引用本文： 郝昕蕾, 袁滿, 陳劉貴, 王文俊, 金瑋, 楊安懷. 18例內源性眼內炎患者的臨床特征和納米孔技術測序結果. 中華眼底病雜志, 2022, 38(5): 396-399. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210823-00456 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中華眼底病雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
內源性眼內炎（EE）診斷金標準為病原體培養[1]。但苛養微生物存在或接受抗生素治療后其培養陽性率下降，目前感染性疾病中病原體培養陽性率為40%～70%[2]。納米孔測序技術（NST）具有長讀長測序、周轉時間快、生信分析難度低、便攜等優勢，高覆蓋讀取深度能提供更精確的結果；不僅可以進行微生物物種鑒定，亦能提供毒力、耐藥性、代謝、菌株等方面的信息[3-5]。本研究回顧分析了一組EE患者的臨床特征和NST測序結果，初步評估NST臨床應用的可行性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經武漢大學人民醫院倫理委員會審批（批準號：WDRY2021-KS054）；遵循《赫爾辛基宣言》原則；所有患者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年1月至2020年9月于武漢大學人民醫院眼科檢查確診的EE患者18例22只眼納入本研究。其中，男性11例，女性7例；年齡（54.56±11.82）歲（29～73歲）。單眼14例，其中左眼、右眼分別為5、9例；雙眼4例。
納入標準：（1）有或無全身疾病，臨床診斷為EE；（2）眼內膿性樣本行NST測序和病原體培養；（3）手術或保守治療。排除標準：（1）1年內有開放性眼外傷或內眼手術史；（2）臨床診斷為非感染性葡萄膜炎；（3）眼內樣本未行病原學檢測。
所有患者均行最佳矯正視力（BCVA）、眼壓、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡檢查，必要時行B型超聲以及眼前節、眼底照相檢查。采用Snellen視力表行BCVA檢查，統計時換算為最小分辨角對數（logMAR）視力。眼前數指、手動、光感、無光感分別為logMAR 2.3、2.6、2.9、3.1[6]。
18例患者中，首診眼科17例（94.44%，17/18）；多次人工肝治療后因雙眼脹痛就診1例（5.56%，1/17）。首次出現癥狀至本院就診時間為（26.11±31.27）（1～120）d。有外院就診史13例（72.22%，13/18），其中診斷為眼內炎、葡萄膜炎、青光眼、鞏膜炎分別為7（53.85%，7/13）、3（23.08%，3/13）、2（15.38%，2/13）、1（7.69%，1/13）例。合并全身疾病15例（83.33%，15/18），其中糖尿病、其他系統感染灶（如肺部感染、肝膿腫等）分別為6（33.33%，6/18）、4（22.22%，4/18）例；長期口服糖皮質激素等免疫抑制藥物3例（16.67%，3/18）；帶狀皰疹1例（5.56%，1/18）；胸腺腫瘤切除手術后化學藥物治療中1例（5.56%，1/18）。發病前有發熱史3例（16.67%，3/18）；特殊工作環境史1例（5.56%，1/18）。
所有患者均給予全身經驗性廣譜抗細菌或真菌藥物以及眼局部散瞳、抗感染滴眼液治療。22只眼中，行玻璃體切割手術（PPV）17只眼（77.27%，17/22），其中因眼部感染未控制行二次手術剜除眼內容物1只眼；因眼底白色“粟粒樣”病灶（圖1）給予視網膜激光光凝治療1只眼（4.54%，1/22）；保守治療2例3只眼（13.64%，3/22）（圖2）；一期行眼內容物剜除手術1只眼（4.54%，1/22）。行PPV治療者，手術中盡可能清除前房及玻璃體腔膿性病灶及炎性滲出，聯合玻璃體腔注射抗細菌或真菌藥物，必要時行白內障超聲乳化吸除徹底清除玻璃體基底部病灶。保守治療的2例中，因全身情況差無法耐受手術1例，抽取房水行病原學檢測，全身抗真菌治療；因眼部脹痛拒絕手術1例，給予系統性抗細菌藥物治療。
圖1
內源性眼內炎患者左眼彩色眼底像。鼻下方視網膜“粟粒樣”病灶
圖2
行保守治療的內源性眼內炎患者雙眼治療前眼前節像。2A、2B分別示右眼、左眼。右眼前房大量纖維素性滲出，左眼前房白色團塊樣積膿
18例患者中，雙眼眼內液行病原學培養和NST測序檢測1例，患眼或較嚴重眼內膿性病灶行病原學培養和NST測序17例，共計采集樣本19個。眼內膿性樣本于無菌條件下采集，20 000 ×g高速離心10 min，棄上清液，留取200 μl沉淀用于核酸提取。應用Sanure DNA Extraction Kit提取試劑盒（圣湘生物科技股份有限公司）提取微生物DNA。
16s rRNA的擴增產物和ITS1/2的擴增產物根據10∶3質量比進行混合，使用1D連接試劑盒（SQK-LSK109，英國牛津納米孔）。文庫使用Oxford Nanopore MinION測序儀進行測序。采用Albacore v2.3.1軟件對MinION生成的Fast5文件進行basecalled和demultiplexed，讀數質量小于7的過濾掉。Porechop用于原始數據中標簽與接頭序列修剪。將過濾后的測序讀數通過Blast映射到美國國家生物技術信息中心FTP 16S rDNA/ITS參考數據庫下載的參考數據庫（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci）中進行比對，從而對每個讀數進行分類[7]。
污染控制，取材過程：（1）房水采集于消毒暗室中進行，前房穿刺前抗生素滴眼液點眼，5 min/次，6次；皮膚消毒、結膜囊沖洗，1 ml無菌注射器抽取房水。（2）玻璃體液采集均在無菌層流手術室按常規操作進行，PPV前未行灌注液時抽取玻璃體腔病灶。（3）采集樣本放入無菌EP管中，低溫儲存。檢測過程：（1）樣本制備過程中，無菌試劑和經紫外線及酒精充分清潔的自動化提取設備進行核酸制備操作，提取環節避免高溫引發氣溶膠。（2）聚合酶鏈反應擴增過程中，TE緩沖液作為陰性對照；臨床少見病原體作為陽性對照，排除假陰性結果（如核酸提取、文庫制備或信息學故障），使用相同批次的試劑和工作流程將二者作為單獨的樣品處理。
采用SPSS26.0軟件行統計學分析。計數資料以構成比表示。采用非參數檢驗、Spearman相關性分析、χ2檢驗等統計方法。所有檢驗采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
22只眼中，眼壓升高4只眼（18.18%，4/22）；前房炎性反應17只眼（77.27%，17/22），其中合并前房積膿10只眼（45.45%，10/22）（黃色、綠色積膿各1只眼）。所有患眼手術中或B型超聲檢查均提示玻璃體腔積膿。行PPV的17只眼中，彌散性、局灶性膿液分別為14（82.35%，14/17）、3（17.65%，3/17）只眼；合并視網膜下膿腫2只眼（11.76%，2/17）。
患眼治療前、出院時logMAR BCVA分別為2.60±0.76、2.36±0.91；治療前后BCVA比較，差異無統計學意義（Z=－1.126，P=0.260）。相關性分析結果顯示，出院時BCVA與治療前BCVA有相關性（r=0.833，P＜0.001）。出院時，前房積膿、未積膿患眼logMAR BCVA分別為2.59±0.66、2.17±1.07，差異無統計學意義（Z=－0.853，P=0.394）；外院誤診、未誤診患眼logMAR BCVA分別為2.50±0.80、1.96±1.16，差異無統計學意義（Z=－0.980，P=0.327）。
行PPV治療的17只眼中，手術后眼部感染未能控制1只眼（5.88%，1/17），再次行眼內容物剜除手術（4.54%，1/22）；行光凝治療的1只眼，出院時BCVA提高。保守治療的2例3只眼中，雙眼患者，雙眼眼前節炎性反應減輕，眼痛緩解，右眼BCVA提高，左眼無改善；單眼患者，眼痛緩解。
18例患者中，白細胞計數、中性粒細胞、C反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A、紅細胞沉降率、降鈣素原升高分別為8（44.44%，8/18）、10（55.56%，10/18）、12（66.67%，12/18）、12（66.67%，12/18）、11（61.11%，11/18）、10（55.56%，10/18）例。相關性分析結果顯示，以上指標均與出院BCVA無相關性（r=0.104、0.163、0.089、0.239、0.071、0.219，P=0.645、0.470、0.694、0.284、0.753、0.328）。
19個樣本中，病原體培養、NST測序陽性分別為6（31.58%，6/19）、18（94.74%，18/19）個，差異有統計學意義（χ2=13.685，P＜0.001）。病原體培養陽性樣本均檢出單一病原體，其中細菌、真菌分別為4（66.67%，4/6）、2（33.33%，2/6）個。NST測序陽性18個樣本中，檢出1～4種病原體分別為6（31.58%，6/19）、8（42.10%，8/19）、3（15.79%，3/19）、1（5.26%，1/19）個。其中，僅檢出細菌、真菌分別為9（47.37%，9/19）、2（10.53%，2/19）個；細菌和真菌同時存在7個（36.84%，7/19）。病原體培養陽性6個樣本中，與NST測序結果完全一致3個（50%，3/6）；NST測序除檢出培養病原體外，同時發現其他病原體3個。
細菌、真菌培養時間分別為3～4、5～7 d；而無論細菌或真菌感染，獲得NST測序細菌、真菌時間均為1～2 d。隨時間推移，病原體培養得到多份檢測報告。與最早病原體培養報告時間比較，NST測序結果所用時間更短，差異有統計學意義（Z=－3.831，P＜0.001）。
3 討論
EE多發生于免疫功能缺陷人群，常見危險因素包括糖尿病、惡性腫瘤、肝膿腫、吸毒、廣譜抗生素應用、留置靜脈導管等[6, 8-9]。不同地區易感因素有地域差異，本組患者均來自湖北省內，最常見誘因為糖尿病，其次為合并肝膿腫等其他部位感染、系統性使用糖皮質激素和前驅發熱史。
脈絡膜血供豐富且血流較慢，病原體易隨血液循環定植于此，因此眼內感染往往從眼后節開始，部分合并視網膜下膿腫[1, 10]。本組所有患眼均有玻璃體腔炎癥反應，合并視網膜下膿腫2只眼。文獻報道，因右眼血供從頸內動脈流出更為直接，右眼更易感染[11]，本研究結果與此一致。相較于同期外源性眼內炎，EE從首次出現癥狀至本院就診時間長，臨床特征缺乏特異性，全身病史疏漏和病原體培養陰性結果，易導致誤診或漏診；部分病原體如白色念珠菌性眼內炎常偽裝成葡萄膜炎，初診誤診率達50%[10, 12]。本組患者多有外院就診史，誤診率為46.15%（6/13），外院診斷為葡萄膜炎或鞏膜炎均接受系統和局部糖皮質激素治療，眼部癥狀先緩解后逐漸加重。
EE病原學診斷金標準為病原體培養，但陽性率不高[1, 5]。隨著測序技術的不斷革新為感染性疾病的病原學診斷提供了新的思路，NST作為三代測序方法之一，利用納米孔進行測序，根據不同核苷酸堿基通過納米孔時電流變化區分堿基，實現測序目的[3-4]，具有實時數據采集、便攜、長讀序列長等特點[4]。MinION測序儀攜帶方便，能夠現場檢測，數據周轉快，已在烏蘇圖病毒、埃博拉病毒等流行病檢測中顯示其穩定性，成為追蹤疾病爆發和傳播動態的有效工具[5, 13-15]。本研究所有NST測序結果均在48 h內得到，明顯短于病原體培養時間，檢出陽性率明顯高于培養陽性率，提示臨床應用可行性。
相比于二代測序，NST讀長更長，可跨越大多數重復序列，能完整組裝復雜微生物基因組[5]。Sanderson等[16]同時利用NST和Illumina宏基因組測序檢測感染樣本，NST在1個樣本中展示了較高物種水平的分辨率，而二代測序只能鑒定至屬水平，其余樣本中，兩種測序與培養結果一致。對于基因組水平高度相似的物種，NST結果更為準確[5, 16-17]。研究證明，基于16S rRNA和ITS序列的納米孔靶向測序能成功識別臨床血液樣本中的細菌或真菌，并被Sanger測序證實，二者核苷酸序列的一致率達99%[18]。
本研究結果顯示，NST測序檢出細菌感染、真菌感染以及兩者共同感染比例分別為47.37%、10.53%、36.84%；病原體培養結果與之類似。文獻報道，以白色念珠菌為主的真菌感染較為普遍，尤其在西方國家[8, 19]。另有學者報道，亞洲地區細菌感染占多數，革蘭陰性菌特別是與肝膿腫相關的肺炎克雷伯桿菌較為常見[9, 20]。本組患眼檢出細菌感染數量多，可能與地域差異、樣本量較小、細菌性EE發病率升高有關。NST測序檢出多種病原體比例較高，可能與測序技術特點有關。病原體培養中優勢菌的存在可能影響其他病原體的檢出，苛養微生物的存在或接受抗生素治療會導致培養陽性率降低[4]，而NST測序對于病原微生物的發現沒有偏倚性。
測序技術局限性在于檢測樣品、試劑或實驗室環境中微生物污染，致使結果的解釋分析變得復雜[21]。因此，需秉持無菌操作理念，遵守工作流程及質量控制程序，盡可能保持無菌和無核酸的測試環境；使用陰性對照、試劑評估和定期檢查，確保實驗室和樣品交叉污染不產生假陽性結果；熟悉臨床樣本中常見的微生物菌群[22-24]。
本研究最終接受眼內容物剜除手術的2只眼中，眼壓均高于正常，推測眼壓對于EE患者眼球是否得以保留具有提示性，但尚需更多研究加以驗證。本研究存在的局限性：（1）納入研究樣本量較少，取材時間不一致，前期抗感染治療可能影響樣本中病原體數量；（2）NST測序結果未經聚合酶鏈反應或Sanger、二代測序驗證；（3）研究期間因新冠疫情部分患者失訪，僅記錄出院視力。
內源性眼內炎（EE）診斷金標準為病原體培養[1]。但苛養微生物存在或接受抗生素治療后其培養陽性率下降，目前感染性疾病中病原體培養陽性率為40%～70%[2]。納米孔測序技術（NST）具有長讀長測序、周轉時間快、生信分析難度低、便攜等優勢，高覆蓋讀取深度能提供更精確的結果；不僅可以進行微生物物種鑒定，亦能提供毒力、耐藥性、代謝、菌株等方面的信息[3-5]。本研究回顧分析了一組EE患者的臨床特征和NST測序結果，初步評估NST臨床應用的可行性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經武漢大學人民醫院倫理委員會審批（批準號：WDRY2021-KS054）；遵循《赫爾辛基宣言》原則；所有患者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年1月至2020年9月于武漢大學人民醫院眼科檢查確診的EE患者18例22只眼納入本研究。其中，男性11例，女性7例；年齡（54.56±11.82）歲（29～73歲）。單眼14例，其中左眼、右眼分別為5、9例；雙眼4例。
納入標準：（1）有或無全身疾病，臨床診斷為EE；（2）眼內膿性樣本行NST測序和病原體培養；（3）手術或保守治療。排除標準：（1）1年內有開放性眼外傷或內眼手術史；（2）臨床診斷為非感染性葡萄膜炎；（3）眼內樣本未行病原學檢測。
所有患者均行最佳矯正視力（BCVA）、眼壓、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡檢查，必要時行B型超聲以及眼前節、眼底照相檢查。采用Snellen視力表行BCVA檢查，統計時換算為最小分辨角對數（logMAR）視力。眼前數指、手動、光感、無光感分別為logMAR 2.3、2.6、2.9、3.1[6]。
18例患者中，首診眼科17例（94.44%，17/18）；多次人工肝治療后因雙眼脹痛就診1例（5.56%，1/17）。首次出現癥狀至本院就診時間為（26.11±31.27）（1～120）d。有外院就診史13例（72.22%，13/18），其中診斷為眼內炎、葡萄膜炎、青光眼、鞏膜炎分別為7（53.85%，7/13）、3（23.08%，3/13）、2（15.38%，2/13）、1（7.69%，1/13）例。合并全身疾病15例（83.33%，15/18），其中糖尿病、其他系統感染灶（如肺部感染、肝膿腫等）分別為6（33.33%，6/18）、4（22.22%，4/18）例；長期口服糖皮質激素等免疫抑制藥物3例（16.67%，3/18）；帶狀皰疹1例（5.56%，1/18）；胸腺腫瘤切除手術后化學藥物治療中1例（5.56%，1/18）。發病前有發熱史3例（16.67%，3/18）；特殊工作環境史1例（5.56%，1/18）。
所有患者均給予全身經驗性廣譜抗細菌或真菌藥物以及眼局部散瞳、抗感染滴眼液治療。22只眼中，行玻璃體切割手術（PPV）17只眼（77.27%，17/22），其中因眼部感染未控制行二次手術剜除眼內容物1只眼；因眼底白色“粟粒樣”病灶（圖1）給予視網膜激光光凝治療1只眼（4.54%，1/22）；保守治療2例3只眼（13.64%，3/22）（圖2）；一期行眼內容物剜除手術1只眼（4.54%，1/22）。行PPV治療者，手術中盡可能清除前房及玻璃體腔膿性病灶及炎性滲出，聯合玻璃體腔注射抗細菌或真菌藥物，必要時行白內障超聲乳化吸除徹底清除玻璃體基底部病灶。保守治療的2例中，因全身情況差無法耐受手術1例，抽取房水行病原學檢測，全身抗真菌治療；因眼部脹痛拒絕手術1例，給予系統性抗細菌藥物治療。
圖1
內源性眼內炎患者左眼彩色眼底像。鼻下方視網膜“粟粒樣”病灶
圖2
行保守治療的內源性眼內炎患者雙眼治療前眼前節像。2A、2B分別示右眼、左眼。右眼前房大量纖維素性滲出，左眼前房白色團塊樣積膿
18例患者中，雙眼眼內液行病原學培養和NST測序檢測1例，患眼或較嚴重眼內膿性病灶行病原學培養和NST測序17例，共計采集樣本19個。眼內膿性樣本于無菌條件下采集，20 000 ×g高速離心10 min，棄上清液，留取200 μl沉淀用于核酸提取。應用Sanure DNA Extraction Kit提取試劑盒（圣湘生物科技股份有限公司）提取微生物DNA。
16s rRNA的擴增產物和ITS1/2的擴增產物根據10∶3質量比進行混合，使用1D連接試劑盒（SQK-LSK109，英國牛津納米孔）。文庫使用Oxford Nanopore MinION測序儀進行測序。采用Albacore v2.3.1軟件對MinION生成的Fast5文件進行basecalled和demultiplexed，讀數質量小于7的過濾掉。Porechop用于原始數據中標簽與接頭序列修剪。將過濾后的測序讀數通過Blast映射到美國國家生物技術信息中心FTP 16S rDNA/ITS參考數據庫下載的參考數據庫（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci）中進行比對，從而對每個讀數進行分類[7]。
污染控制，取材過程：（1）房水采集于消毒暗室中進行，前房穿刺前抗生素滴眼液點眼，5 min/次，6次；皮膚消毒、結膜囊沖洗，1 ml無菌注射器抽取房水。（2）玻璃體液采集均在無菌層流手術室按常規操作進行，PPV前未行灌注液時抽取玻璃體腔病灶。（3）采集樣本放入無菌EP管中，低溫儲存。檢測過程：（1）樣本制備過程中，無菌試劑和經紫外線及酒精充分清潔的自動化提取設備進行核酸制備操作，提取環節避免高溫引發氣溶膠。（2）聚合酶鏈反應擴增過程中，TE緩沖液作為陰性對照；臨床少見病原體作為陽性對照，排除假陰性結果（如核酸提取、文庫制備或信息學故障），使用相同批次的試劑和工作流程將二者作為單獨的樣品處理。
采用SPSS26.0軟件行統計學分析。計數資料以構成比表示。采用非參數檢驗、Spearman相關性分析、χ2檢驗等統計方法。所有檢驗采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
22只眼中，眼壓升高4只眼（18.18%，4/22）；前房炎性反應17只眼（77.27%，17/22），其中合并前房積膿10只眼（45.45%，10/22）（黃色、綠色積膿各1只眼）。所有患眼手術中或B型超聲檢查均提示玻璃體腔積膿。行PPV的17只眼中，彌散性、局灶性膿液分別為14（82.35%，14/17）、3（17.65%，3/17）只眼；合并視網膜下膿腫2只眼（11.76%，2/17）。
患眼治療前、出院時logMAR BCVA分別為2.60±0.76、2.36±0.91；治療前后BCVA比較，差異無統計學意義（Z=－1.126，P=0.260）。相關性分析結果顯示，出院時BCVA與治療前BCVA有相關性（r=0.833，P＜0.001）。出院時，前房積膿、未積膿患眼logMAR BCVA分別為2.59±0.66、2.17±1.07，差異無統計學意義（Z=－0.853，P=0.394）；外院誤診、未誤診患眼logMAR BCVA分別為2.50±0.80、1.96±1.16，差異無統計學意義（Z=－0.980，P=0.327）。
行PPV治療的17只眼中，手術后眼部感染未能控制1只眼（5.88%，1/17），再次行眼內容物剜除手術（4.54%，1/22）；行光凝治療的1只眼，出院時BCVA提高。保守治療的2例3只眼中，雙眼患者，雙眼眼前節炎性反應減輕，眼痛緩解，右眼BCVA提高，左眼無改善；單眼患者，眼痛緩解。
18例患者中，白細胞計數、中性粒細胞、C反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A、紅細胞沉降率、降鈣素原升高分別為8（44.44%，8/18）、10（55.56%，10/18）、12（66.67%，12/18）、12（66.67%，12/18）、11（61.11%，11/18）、10（55.56%，10/18）例。相關性分析結果顯示，以上指標均與出院BCVA無相關性（r=0.104、0.163、0.089、0.239、0.071、0.219，P=0.645、0.470、0.694、0.284、0.753、0.328）。
19個樣本中，病原體培養、NST測序陽性分別為6（31.58%，6/19）、18（94.74%，18/19）個，差異有統計學意義（χ2=13.685，P＜0.001）。病原體培養陽性樣本均檢出單一病原體，其中細菌、真菌分別為4（66.67%，4/6）、2（33.33%，2/6）個。NST測序陽性18個樣本中，檢出1～4種病原體分別為6（31.58%，6/19）、8（42.10%，8/19）、3（15.79%，3/19）、1（5.26%，1/19）個。其中，僅檢出細菌、真菌分別為9（47.37%，9/19）、2（10.53%，2/19）個；細菌和真菌同時存在7個（36.84%，7/19）。病原體培養陽性6個樣本中，與NST測序結果完全一致3個（50%，3/6）；NST測序除檢出培養病原體外，同時發現其他病原體3個。
細菌、真菌培養時間分別為3～4、5～7 d；而無論細菌或真菌感染，獲得NST測序細菌、真菌時間均為1～2 d。隨時間推移，病原體培養得到多份檢測報告。與最早病原體培養報告時間比較，NST測序結果所用時間更短，差異有統計學意義（Z=－3.831，P＜0.001）。
3 討論
EE多發生于免疫功能缺陷人群，常見危險因素包括糖尿病、惡性腫瘤、肝膿腫、吸毒、廣譜抗生素應用、留置靜脈導管等[6, 8-9]。不同地區易感因素有地域差異，本組患者均來自湖北省內，最常見誘因為糖尿病，其次為合并肝膿腫等其他部位感染、系統性使用糖皮質激素和前驅發熱史。
脈絡膜血供豐富且血流較慢，病原體易隨血液循環定植于此，因此眼內感染往往從眼后節開始，部分合并視網膜下膿腫[1, 10]。本組所有患眼均有玻璃體腔炎癥反應，合并視網膜下膿腫2只眼。文獻報道，因右眼血供從頸內動脈流出更為直接，右眼更易感染[11]，本研究結果與此一致。相較于同期外源性眼內炎，EE從首次出現癥狀至本院就診時間長，臨床特征缺乏特異性，全身病史疏漏和病原體培養陰性結果，易導致誤診或漏診；部分病原體如白色念珠菌性眼內炎常偽裝成葡萄膜炎，初診誤診率達50%[10, 12]。本組患者多有外院就診史，誤診率為46.15%（6/13），外院診斷為葡萄膜炎或鞏膜炎均接受系統和局部糖皮質激素治療，眼部癥狀先緩解后逐漸加重。
EE病原學診斷金標準為病原體培養，但陽性率不高[1, 5]。隨著測序技術的不斷革新為感染性疾病的病原學診斷提供了新的思路，NST作為三代測序方法之一，利用納米孔進行測序，根據不同核苷酸堿基通過納米孔時電流變化區分堿基，實現測序目的[3-4]，具有實時數據采集、便攜、長讀序列長等特點[4]。MinION測序儀攜帶方便，能夠現場檢測，數據周轉快，已在烏蘇圖病毒、埃博拉病毒等流行病檢測中顯示其穩定性，成為追蹤疾病爆發和傳播動態的有效工具[5, 13-15]。本研究所有NST測序結果均在48 h內得到，明顯短于病原體培養時間，檢出陽性率明顯高于培養陽性率，提示臨床應用可行性。
相比于二代測序，NST讀長更長，可跨越大多數重復序列，能完整組裝復雜微生物基因組[5]。Sanderson等[16]同時利用NST和Illumina宏基因組測序檢測感染樣本，NST在1個樣本中展示了較高物種水平的分辨率，而二代測序只能鑒定至屬水平，其余樣本中，兩種測序與培養結果一致。對于基因組水平高度相似的物種，NST結果更為準確[5, 16-17]。研究證明，基于16S rRNA和ITS序列的納米孔靶向測序能成功識別臨床血液樣本中的細菌或真菌，并被Sanger測序證實，二者核苷酸序列的一致率達99%[18]。
本研究結果顯示，NST測序檢出細菌感染、真菌感染以及兩者共同感染比例分別為47.37%、10.53%、36.84%；病原體培養結果與之類似。文獻報道，以白色念珠菌為主的真菌感染較為普遍，尤其在西方國家[8, 19]。另有學者報道，亞洲地區細菌感染占多數，革蘭陰性菌特別是與肝膿腫相關的肺炎克雷伯桿菌較為常見[9, 20]。本組患眼檢出細菌感染數量多，可能與地域差異、樣本量較小、細菌性EE發病率升高有關。NST測序檢出多種病原體比例較高，可能與測序技術特點有關。病原體培養中優勢菌的存在可能影響其他病原體的檢出，苛養微生物的存在或接受抗生素治療會導致培養陽性率降低[4]，而NST測序對于病原微生物的發現沒有偏倚性。
測序技術局限性在于檢測樣品、試劑或實驗室環境中微生物污染，致使結果的解釋分析變得復雜[21]。因此，需秉持無菌操作理念，遵守工作流程及質量控制程序，盡可能保持無菌和無核酸的測試環境；使用陰性對照、試劑評估和定期檢查，確保實驗室和樣品交叉污染不產生假陽性結果；熟悉臨床樣本中常見的微生物菌群[22-24]。
本研究最終接受眼內容物剜除手術的2只眼中，眼壓均高于正常，推測眼壓對于EE患者眼球是否得以保留具有提示性，但尚需更多研究加以驗證。本研究存在的局限性：（1）納入研究樣本量較少，取材時間不一致，前期抗感染治療可能影響樣本中病原體數量；（2）NST測序結果未經聚合酶鏈反應或Sanger、二代測序驗證；（3）研究期間因新冠疫情部分患者失訪，僅記錄出院視力。
