引用本文： 劉源欣, 付來華, 劉昊天, 張耕溥, 肖婉祎, 高梓唯, 張洪亮, 楊吉龍. 惡性周圍神經鞘瘤中細胞周期蛋白依賴性激酶1的表達及其臨床意義. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(10): 1220-1228. doi: 10.7507/1002-1892.202406090 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
惡性周圍神經鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一種罕見且具有高度侵襲性的軟組織肉瘤，起源于周圍神經或其鞘膜，多見于20～50歲人群，占所有軟組織肉瘤的5%～10%。該腫瘤的發病與Ⅰ型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）密切相關，約50% MPNST患者發生于NF1患者中。MPNST具有高度惡性特性，易復發和轉移，預后較差。盡管手術切除是主要治療手段，但由于腫瘤的侵襲性和復雜的生物學行為，臨床治療效果有限。
MPNST的相關基因組學分析研究表明，NF1雙等位基因的功能性缺失和RAS基因異常激活、CDKN2A基因組位點的雜合性缺失是MPNST細胞發生中上游突變的關鍵環節[1]。細胞周期蛋白依賴性激酶1（cell-cycle dependent kinase 1，CDK1）作為一種參與調控細胞增殖和遷移、炎癥反應、免疫應激的關鍵因子，已逐漸被國內外學者關注[2]。CDK1作為細胞周期的核心調控因子，其異常表達與多種癌癥的發生、發展密切相關，如在乳腺癌、肺癌和胃癌中CDK1為高表達狀態，且與腫瘤細胞增殖加快、侵襲性增強和患者預后較差相關[3-4]。
為了研究CDK1在MPNST中的分子生物學特性以及其臨床意義，本研究對來自天津市腫瘤醫院的MPNST樣本和正常組織樣本進行了轉錄組測序，并結合外部數據集進行生物信息學分析，進一步利用免疫組織化學染色分析CDK1蛋白在MPNST組織中的表達情況，為臨床治療策略提供新的方向。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2011年9月—2020年3月于天津市腫瘤醫院接受手術切除治療，并經組織學、病理學證實的56例MPNST患者腫瘤樣本及17例正常組織樣本（同一MPNST患者距離腫瘤邊緣5 cm以上的非腫瘤組織）作為研究對象。其中男32例，女24例；年齡12～82歲，平均51歲。病變位于四肢22例，頭頸部1例，軀干14例，內臟7例，其他部位10例。患者入院時39例為原發病灶，17例為復發病灶。其中NF1型患者12例（21.4%）。腫瘤為單發42例，多發14例；腫瘤最大徑2.0～18.0 cm，平均7.1 cm，其中<5 cm 21例，5～10 cm 26例，>10 cm 9例。術后復發12例（21.4%），遠處轉移（遠隔部位皮膚、軟組織、器官的轉移和/或非區域淋巴結轉移）13例（23.2%）；接受化療23例，放療13例。將切除后的腫瘤和正常組織置入–196℃超低溫液氮罐凍存。
1.2 轉錄組測序及生物信息學分析
1.2.1 轉錄組測序
取56例MPNST患者的冷凍組織和17例正常組織樣本，采用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）提取RNA，按照MGlEasy mRNA文庫試劑盒（深圳華大智造科技股份有限公司）方法構建mRNA文庫，在DNBSEO-G400測序儀（深圳華大智造科技股份有限公司）上對PE150循環的mRNA文庫進行測序。使用子讀取對齊器將讀段與人類參考基因組 （GRCh38） 進行比對，在計算機R studio軟件中利用edgeR R包對RNA讀取計數進行歸一化，將每個RNA的表達轉化為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的轉錄本，并將56例患者轉錄組測序得到的基因集和基因表達矩陣命名為“Tianjin”數據集[5]。
1.2.2 基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus database，GEO）、癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫檢索
檢索GEO，共得到4個包含較大MPNST樣本量的轉錄組測序數據集，分別為GSE141438 RNA測序 ［7例MPNST，7例正常，3例神經纖維瘤（neurofibromatosis，NF）］、GSE145064 RNA測序 ［25例MPNST，21例叢狀神經纖維瘤（plexiform neurofibromas，PNF）］、GSE140987 MicroRNA（10例散發，9例PNF，9例MPNST）、GSE66743芯片（30例MPNST，8例NF）。TCGA數據庫中，根據組織來源不同，檢索得到包含脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、未分化多形性肉瘤、黏液纖維肉瘤、MPNST和滑膜肉瘤等肉瘤亞型共計263例肉瘤樣本及2例正常組織樣本相關信息。
1.2.3 基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）及基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）
使用GSVA包（v1.34.0）和R中的pheatmap包（v1.0.12）對Tianjin和GSE141438數據集進行GSVA和GSEA分析，篩選轉錄水平表達升高的通路。并對篩選得到的通路取交集，得到差異表達基因。
1.2.4 蛋白間互作網絡（Protein-Protein interaction networks，PPI）構建及Cytoscape軟件可視化
使用STRING 11.5數據庫（https://string-db.org/）預測通路分析得到的差異基因編碼PPI。設置“minimum required interaction score”為0.4。利用Cytoscape v3.7.0軟件（NDEX公司，美國）將上述結果可視化。
1.3 差異表達分析
根據TCGA數據庫中的肉瘤及正常組織樣本轉錄組測序數據，分析CDK1 mRNA在肉瘤與正常組織中的表達差異。選擇包含生存信息的Tianjin數據集和GSE141438數據集，分析CDK1 mRNA在MPNST與正常組織中的表達水平差異。進一步分析GSE66743、GSE145064數據集中CDK1 mRNA在MPNST與NF組織和PNF組織表達水平差異。利用TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064這4個數據集對比其他CDK家族成員（CDK2～8）在MPNST與正常組織、NF組織、PNF組織中的mRNA表達水平。
1.4 免疫組織化學染色觀察
取56例MPNST患者組織樣本，經甲醛固定、石蠟包埋后構建組織微矩陣（經病理科專業醫師再次確認并核對病理結果后，標記典型腫瘤區域進行組織芯片制作）。按常規方法行CDK1免疫組織化學染色，從每個組織中隨機挑選10個視野，根據免疫組織化學染色結果評分標準[6]，對每個視野中的CDK1陽性細胞進行計數。實驗采用雙盲法，由至少2名病理學專家進行評定。并計算CDK1蛋白表達率，公式：CDK1陽性細胞數/腫瘤細胞總數×100%。
1.5 生存分析及生存風險評估
根據CDK1 mRNA在病變組織中表達的中位值將患者分為低表達組和高表達組；根據56例MPNST患者組織微矩陣免疫組織化學染色結果將患者分為CDK1蛋白陽性（CDK1-positive）組與CDK1蛋白陰性（CDK1-negative）組；通過Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗比較組間患者生存差異，并繪制患者Kaplan-Meier生存曲線。
1.6 統計學方法
采用R studio、R 4.2.2軟件及SPSS25.0、GraphPad Prism 8軟件進行統計分析和繪圖，利用Cytoscape v3.7.0軟件進行PPI結果可視化。計量資料經正態性檢驗，符合正態分布的數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的數據以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
2.1 CDK1 為篩選得到的樞紐基因
對Tianjin數據集轉錄組測序結果通路分析，GSVA分析發現相較于正常組織，MPNST中表達升高的基因在E2F、G2M、EMT 3條通路顯著富集。GSEA分析同樣發現，與正常組織相比，MPNST表達升高的基因在E2F、G2M、EMT 3條通路顯著富集。見圖1a～c。通過分析GSE141438數據集，GSVA、GSEA均發現轉錄水平表達升高的基因在E2F和G2M 2條通路顯著富集。見圖1d～f。
圖1
CDK1 mRNA表達水平檢測
a. 聚類熱圖示Tianjin數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；b、c. GSEA分析示Tianjin數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；d. 聚類熱圖示GSE141438數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；e、f. GSEA分析示GSE141438數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；g. PPI分析示CDK1蛋白是節點數最高的節點蛋白；h. Cytoscape軟件可視化查找得到CDK1為樞紐基因
Figure1. Detection of CDK1 mRNA expressiona. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; b, c. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; d. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; e, f. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; g. PPI analysis revealed that CDK1 protein was the node protein with the highest number of connections; h. Cytoscape software visualizes and identifies CDK1 as a hub gene
對Tianjin數據集及GSE141438數據集中整體表達均升高的2條通路（E2F、G2M）取交集，共得到25個差異表達基因。PPI分析表明，CDK1蛋白的節點數為20（圖1g）；并利用Cytoscape軟件進行可視化，發現CDK1基因的關聯強度高于其他差異表達基因，CDK1為樞紐基因（圖1h）。
2.2 CDK1 mRNA表達水平在肉瘤、MPNST中顯著升高
TCGA包含的263例肉瘤樣本中CDK1 mRNA表達水平較2例正常組織樣本顯著上升（P<0.05）；Tianjin、GSE141438數據集中MPNST相較于正常組織，CDK1 mRNA表達顯著上升（P<0.05）。見圖2a～c。
圖2
CDK1 在肉瘤、MPNST組織中的表達情況及其表達高低與預后的關系
a. TCGA數據庫中CDK1 mRNA表達 *
a. CDK1 mRNA expression in the TCGA database *
2.3 肉瘤、MPNST中CDK1 蛋白、mRNA表達水平與患者預后關系
免疫組織化學染色示，CDK1蛋白在MPNST組織中的表達率為40.31%。結合患者臨床隨訪信息，根據CDK1蛋白在腫瘤組織中陽性表達水平將患者分為CDK1-positive組（n=4）和CDK1-negative組（n=36）。生存分析結果表明CDK1-positive組與CDK1-negative組中位總生存期分別為25.19個月和33.30個月，差異無統計學意義（P>0.05）。CDK1-positive組整體生存趨勢較CDK1-negative組差。見圖2d～f。
在CDK1 mRNA表達水平層面，Kaplan-Meier生存分析示，TCGA數據庫和GSE66743數據集中的肉瘤、MPNST患者CDK1高表達組生存時間與低表達組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。在TCGA的263例肉瘤數據中，共有259例肉瘤患者有生存數據，CDK1 mRNA高表達組（n=130）和低表達組（n=129）中位總生存期分別為4.75年和6.75年，差異有統計學意義（P<0.05）。GSE66743數據集中29例MPNST患者CDK1 mRNA高表達組（n=16）與低表達組（n=13）中位總生存期分別為19 個月和NA，差異有統計學意義（P<0.05）。263例肉瘤患者樣本中包含9例MPNST樣本（CDK1高表達組n=5，低表達組n=4），Kaplan-Meier生存分析示差異無統計學意義（P>0.05），可能與樣本量較小有關，但生存曲線整體趨勢仍顯示CDK1高表達組患者預后較差。見圖2g～i。
2.4 CDK1和其他CDK家族在MPNST中表達特點
與NF和PNF組織相比，CDK1 mRNA的表達在MPNST患者中顯著上調 ［GSE66743、GSE145064數據集（P<0.05）］。GSE66743數據集中CDK2 mRNA在MPNST和NF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；GSE66743、GSE145064數據集中CDK3 mRNA在MPNST與NF及PNF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；TCGA數據庫中CDK4 mRNA在肉瘤組織與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；GSE145064數據集中CDK5 mRNA在MPNST與PNF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05），TCGA數據庫中CDK5 mRNA在肉瘤與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；GSE145064數據集、GSE66743數據集和TCGA數據庫中CDK6 mRNA在MPNST與NF、PNF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05），在肉瘤與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064數據集中CDK7 mRNA在MPNST與正常、NF、PNF組織中表達差異均無統計學意義（P>0.05），在肉瘤與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064數據集中CDK8 mRNA在MPNST與正常、NF、PNF組織中表達差異均無統計學意義（P>0.05），在肉瘤組織中表達低于正常組織，但差異無統計學意義（P>0.05）。因此，在轉錄組水平上，CDK家族成員中只有CDK1在MPNST中表達與正常組織、NF組織和PNF組織差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3、4。
圖3
CDK1～4 mRNA在各組織中的表達情況 *P<0.05
a. GSE66743數據集中CDK1 mRNA表達；b. GSE145064數據集中CDK1 mRNA表達；c～f. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中CDK2 mRNA表達；g～i. Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中CDK3 mRNA表達；j～m. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中CDK4 mRNA表達
Figure3. Expression of CDK1-4 mRNA in various tissues *P<0.05a. Expression of CDK1 mRNA in the GSE66743 dataset; b. Expression of CDK1 mRNA in the GSE145064 dataset; c-f. Expression of CDK2 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; g-i. Expression of CDK3 mRNA in the Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; j-m. Expression of CDK4 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets
圖4
CDK5～8 mRNA在各組織中的表達情況 *P<0.05
從左至右依次為TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中 a. CDK5 mRNA；b. CDK6 mRNA；c. CDK7 mRNA；d. CDK8 mRNA
Figure4. Expression of CDK5-8 mRNA in various tissues *P<0.05From left to right for TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets, respectively a. CDK5 mRNA; b. CDK6 mRNA; c. CDK7 mRNA; d. CDK8 mRNA
3 討論
CDK1蛋白是細胞周期調控的關鍵酶，本研究進一步表明其在MPNST中扮演著重要角色。既往研究表明，CDK1在諸多瘤種中的高表達與腫瘤的快速增殖、侵襲性增高和較差的預后密切相關[2，7-10]。基于轉錄組測序和生物信息學分析，我們發現CDK1在MPNST腫瘤樣本中的轉錄水平顯著高于正常組織，這一發現得到了公共數據集的支持。CDK1的異常高表達通常伴隨著腫瘤細胞增殖加速和惡性行為的增強。本研究進一步行生存分析顯示，存在CDK1轉錄上調的MPNST患者其生存時間顯著低于低表達組，MPNST組織中CDK1蛋白表達陽性患者生存趨勢較表達陰性患者差。提示CDK1可能是影響MPNST患者預后的重要因素。這些研究結果不僅揭示了CDK1在MPNST中的關鍵作用，還表明其表達水平可以作為評估MPNST患者預后的潛在生物標志物。
CDK1在多個瘤種中被證實是參與腫瘤發生、發展的關鍵因子。研究表明[9，11]，CDK1高表達與胰腺導管細胞癌患者較差的預后相關，靶向CDK1能夠通過誘導G2/M期阻滯、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤干細胞等方式治療胰腺導管細胞癌。本研究結果顯示CDK1 mRNA在MPNST中的轉錄上調與較差的預后相關，且相較于其他CDK家族成員，CDK1在MPNST中表現出獨特的表達模式。我們分析CDK1可能是MPNST發生、發展過程中的關鍵分子，CDK1作為MPNST潛在的治療靶點具有良好研究前景。
CDK1是如何影響MPNST發生、發展的具體機制目前仍未明確。Xu等[12]的研究表明，CDK1表達水平與胰腺導管細胞癌預后相關，敲低CDK1表達會導致胰腺癌細胞腫瘤干性降低并使腫瘤干細胞亞群減少，具體機制是通過調節CDK1的翻譯后修飾，即減少組蛋白去乙酰化酶介導的CDK1去乙酰化，從而減少STAT3的磷酸化來實現的。此外，富含絲氨酸/精氨酸剪接因子9（SRSF9）、癌高甲基化因子1（HIC1）、丙酮酸激酶同工酶M2型（PKM2）、長鏈酰基輔酶A合酶 4 （ASCL-4）、去泛素化酶YOD1等因子也在膠質瘤、膠質母細胞瘤、結直腸癌和三陰性乳腺癌中分別通過不同途徑來調控CDK1表達，進而影響細胞周期進程來影響腫瘤細胞增殖能力、耐藥性等[13-17]。基于上述研究結果， CDK1上下游相關分子也可能通過直接與CDK1啟動子區域結合、表觀遺傳修飾、減少鐵死亡等途徑調控MPNST細胞惡性增殖。CDK1的這些多重作用機制揭示了其在MPNST發生和進展中的核心地位，表明其異常活性可能是導致MPNST細胞逃避正常細胞周期控制和加速腫瘤發展的關鍵因素。
本研究結果表明，CDK家族中僅有CDK1在MPNST中的轉錄相較于正常組織、NF組織和PNF組織均上調，然而本次組織微陣列中免疫組織化學染色陽性表達CDK1蛋白的患者較少，與CDK1 mRNA在MPNST組織中的高表達存在明顯差異。我們分析這種差異是由于CDK1蛋白上、下游存在潛在調節機制亦或是免疫組織化學染色操作等原因造成的。在今后的研究中，我們將重點就CDK1 mRNA的表觀遺傳修飾以及CDK1蛋白的翻譯后修飾進行研究，探尋CDK1 mRNA和蛋白上、下游的具體調節機制。同時，細胞周期的調控復雜多樣，無法忽視其他CDK家族成員分子以及細胞周期調節因子和CDK1蛋白之間的相互作用關系。不僅CDK1蛋白受到WEE1樣蛋白激酶、細胞分裂周期因子（CDC25）等分子對其的磷酸化/去磷酸化調控，研究表明，CDK7也能發揮CDK激酶（CAK）活性磷酸化包含CDK1在內的幾種CDK成員[18-19]。因此，其他CDK分子以及參與細胞周期調控因子與CDK1之間的相互作用同樣不能被忽略，這也是需要進一步探索研究的關鍵之一。
鑒于CDK1在MPNST中的關鍵作用，針對CDK1的抑制成為一種具有潛力的治療策略。初步研究顯示，CDK1抑制劑能夠有效阻止MPNST細胞的增殖，并誘導腫瘤細胞凋亡[20]。這些發現為開發新的MPNST治療方法提供了重要依據。未來研究需要進一步優化CDK1抑制劑的設計，提升其選擇性和效力，同時評估其在臨床應用中的安全性和有效性。此外，結合現有的化療和放療手段，CDK1抑制劑有望增強治療效果，提高患者生存率。值得注意的是，CDK1不僅在MPNST中表現出關鍵作用，在多種惡性腫瘤中也顯示出相似的機制和潛力。因此，針對CDK1的治療策略不僅可能為MPNST患者帶來新的希望，也有望為其他癌癥的治療提供新思路。通過深入研究CDK1在MPNST中的具體作用機制和其作為治療靶點的潛力，我們期待未來能夠開發出更加精準和有效的治療方案，顯著改善MPNST患者預后，并拓展這一策略在其他腫瘤中的應用。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經天津市腫瘤醫院（核）醫學倫理委員會批準（bc2023111）；患者均簽署知情同意書
作者貢獻聲明 劉源欣：免疫組織化學染色、作圖、文章撰寫 ；付來華：數據統計分析、臨床資料收集整理；劉昊天：研究設計、數據統計分析、作圖；張耕溥、肖婉祎：臨床資料收集整理；高梓唯、張洪亮：數據統計分析；楊吉龍：研究指導、論文審閱、實驗設計、經費支持
惡性周圍神經鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一種罕見且具有高度侵襲性的軟組織肉瘤，起源于周圍神經或其鞘膜，多見于20～50歲人群，占所有軟組織肉瘤的5%～10%。該腫瘤的發病與Ⅰ型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）密切相關，約50% MPNST患者發生于NF1患者中。MPNST具有高度惡性特性，易復發和轉移，預后較差。盡管手術切除是主要治療手段，但由于腫瘤的侵襲性和復雜的生物學行為，臨床治療效果有限。
MPNST的相關基因組學分析研究表明，NF1雙等位基因的功能性缺失和RAS基因異常激活、CDKN2A基因組位點的雜合性缺失是MPNST細胞發生中上游突變的關鍵環節[1]。細胞周期蛋白依賴性激酶1（cell-cycle dependent kinase 1，CDK1）作為一種參與調控細胞增殖和遷移、炎癥反應、免疫應激的關鍵因子，已逐漸被國內外學者關注[2]。CDK1作為細胞周期的核心調控因子，其異常表達與多種癌癥的發生、發展密切相關，如在乳腺癌、肺癌和胃癌中CDK1為高表達狀態，且與腫瘤細胞增殖加快、侵襲性增強和患者預后較差相關[3-4]。
為了研究CDK1在MPNST中的分子生物學特性以及其臨床意義，本研究對來自天津市腫瘤醫院的MPNST樣本和正常組織樣本進行了轉錄組測序，并結合外部數據集進行生物信息學分析，進一步利用免疫組織化學染色分析CDK1蛋白在MPNST組織中的表達情況，為臨床治療策略提供新的方向。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2011年9月—2020年3月于天津市腫瘤醫院接受手術切除治療，并經組織學、病理學證實的56例MPNST患者腫瘤樣本及17例正常組織樣本（同一MPNST患者距離腫瘤邊緣5 cm以上的非腫瘤組織）作為研究對象。其中男32例，女24例；年齡12～82歲，平均51歲。病變位于四肢22例，頭頸部1例，軀干14例，內臟7例，其他部位10例。患者入院時39例為原發病灶，17例為復發病灶。其中NF1型患者12例（21.4%）。腫瘤為單發42例，多發14例；腫瘤最大徑2.0～18.0 cm，平均7.1 cm，其中<5 cm 21例，5～10 cm 26例，>10 cm 9例。術后復發12例（21.4%），遠處轉移（遠隔部位皮膚、軟組織、器官的轉移和/或非區域淋巴結轉移）13例（23.2%）；接受化療23例，放療13例。將切除后的腫瘤和正常組織置入–196℃超低溫液氮罐凍存。
1.2 轉錄組測序及生物信息學分析
1.2.1 轉錄組測序
取56例MPNST患者的冷凍組織和17例正常組織樣本，采用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）提取RNA，按照MGlEasy mRNA文庫試劑盒（深圳華大智造科技股份有限公司）方法構建mRNA文庫，在DNBSEO-G400測序儀（深圳華大智造科技股份有限公司）上對PE150循環的mRNA文庫進行測序。使用子讀取對齊器將讀段與人類參考基因組 （GRCh38） 進行比對，在計算機R studio軟件中利用edgeR R包對RNA讀取計數進行歸一化，將每個RNA的表達轉化為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的轉錄本，并將56例患者轉錄組測序得到的基因集和基因表達矩陣命名為“Tianjin”數據集[5]。
1.2.2 基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus database，GEO）、癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫檢索
檢索GEO，共得到4個包含較大MPNST樣本量的轉錄組測序數據集，分別為GSE141438 RNA測序 ［7例MPNST，7例正常，3例神經纖維瘤（neurofibromatosis，NF）］、GSE145064 RNA測序 ［25例MPNST，21例叢狀神經纖維瘤（plexiform neurofibromas，PNF）］、GSE140987 MicroRNA（10例散發，9例PNF，9例MPNST）、GSE66743芯片（30例MPNST，8例NF）。TCGA數據庫中，根據組織來源不同，檢索得到包含脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、未分化多形性肉瘤、黏液纖維肉瘤、MPNST和滑膜肉瘤等肉瘤亞型共計263例肉瘤樣本及2例正常組織樣本相關信息。
1.2.3 基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）及基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）
使用GSVA包（v1.34.0）和R中的pheatmap包（v1.0.12）對Tianjin和GSE141438數據集進行GSVA和GSEA分析，篩選轉錄水平表達升高的通路。并對篩選得到的通路取交集，得到差異表達基因。
1.2.4 蛋白間互作網絡（Protein-Protein interaction networks，PPI）構建及Cytoscape軟件可視化
使用STRING 11.5數據庫（https://string-db.org/）預測通路分析得到的差異基因編碼PPI。設置“minimum required interaction score”為0.4。利用Cytoscape v3.7.0軟件（NDEX公司，美國）將上述結果可視化。
1.3 差異表達分析
根據TCGA數據庫中的肉瘤及正常組織樣本轉錄組測序數據，分析CDK1 mRNA在肉瘤與正常組織中的表達差異。選擇包含生存信息的Tianjin數據集和GSE141438數據集，分析CDK1 mRNA在MPNST與正常組織中的表達水平差異。進一步分析GSE66743、GSE145064數據集中CDK1 mRNA在MPNST與NF組織和PNF組織表達水平差異。利用TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064這4個數據集對比其他CDK家族成員（CDK2～8）在MPNST與正常組織、NF組織、PNF組織中的mRNA表達水平。
1.4 免疫組織化學染色觀察
取56例MPNST患者組織樣本，經甲醛固定、石蠟包埋后構建組織微矩陣（經病理科專業醫師再次確認并核對病理結果后，標記典型腫瘤區域進行組織芯片制作）。按常規方法行CDK1免疫組織化學染色，從每個組織中隨機挑選10個視野，根據免疫組織化學染色結果評分標準[6]，對每個視野中的CDK1陽性細胞進行計數。實驗采用雙盲法，由至少2名病理學專家進行評定。并計算CDK1蛋白表達率，公式：CDK1陽性細胞數/腫瘤細胞總數×100%。
1.5 生存分析及生存風險評估
根據CDK1 mRNA在病變組織中表達的中位值將患者分為低表達組和高表達組；根據56例MPNST患者組織微矩陣免疫組織化學染色結果將患者分為CDK1蛋白陽性（CDK1-positive）組與CDK1蛋白陰性（CDK1-negative）組；通過Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗比較組間患者生存差異，并繪制患者Kaplan-Meier生存曲線。
1.6 統計學方法
采用R studio、R 4.2.2軟件及SPSS25.0、GraphPad Prism 8軟件進行統計分析和繪圖，利用Cytoscape v3.7.0軟件進行PPI結果可視化。計量資料經正態性檢驗，符合正態分布的數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的數據以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
2.1 CDK1 為篩選得到的樞紐基因
對Tianjin數據集轉錄組測序結果通路分析，GSVA分析發現相較于正常組織，MPNST中表達升高的基因在E2F、G2M、EMT 3條通路顯著富集。GSEA分析同樣發現，與正常組織相比，MPNST表達升高的基因在E2F、G2M、EMT 3條通路顯著富集。見圖1a～c。通過分析GSE141438數據集，GSVA、GSEA均發現轉錄水平表達升高的基因在E2F和G2M 2條通路顯著富集。見圖1d～f。
圖1
CDK1 mRNA表達水平檢測
a. 聚類熱圖示Tianjin數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；b、c. GSEA分析示Tianjin數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；d. 聚類熱圖示GSE141438數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；e、f. GSEA分析示GSE141438數據集中表達升高的基因在E2F、G2M通路顯著富集；g. PPI分析示CDK1蛋白是節點數最高的節點蛋白；h. Cytoscape軟件可視化查找得到CDK1為樞紐基因
Figure1. Detection of CDK1 mRNA expressiona. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; b, c. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; d. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; e, f. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; g. PPI analysis revealed that CDK1 protein was the node protein with the highest number of connections; h. Cytoscape software visualizes and identifies CDK1 as a hub gene
對Tianjin數據集及GSE141438數據集中整體表達均升高的2條通路（E2F、G2M）取交集，共得到25個差異表達基因。PPI分析表明，CDK1蛋白的節點數為20（圖1g）；并利用Cytoscape軟件進行可視化，發現CDK1基因的關聯強度高于其他差異表達基因，CDK1為樞紐基因（圖1h）。
2.2 CDK1 mRNA表達水平在肉瘤、MPNST中顯著升高
TCGA包含的263例肉瘤樣本中CDK1 mRNA表達水平較2例正常組織樣本顯著上升（P<0.05）；Tianjin、GSE141438數據集中MPNST相較于正常組織，CDK1 mRNA表達顯著上升（P<0.05）。見圖2a～c。
圖2
CDK1 在肉瘤、MPNST組織中的表達情況及其表達高低與預后的關系
a. TCGA數據庫中CDK1 mRNA表達 *
a. CDK1 mRNA expression in the TCGA database *
2.3 肉瘤、MPNST中CDK1 蛋白、mRNA表達水平與患者預后關系
免疫組織化學染色示，CDK1蛋白在MPNST組織中的表達率為40.31%。結合患者臨床隨訪信息，根據CDK1蛋白在腫瘤組織中陽性表達水平將患者分為CDK1-positive組（n=4）和CDK1-negative組（n=36）。生存分析結果表明CDK1-positive組與CDK1-negative組中位總生存期分別為25.19個月和33.30個月，差異無統計學意義（P>0.05）。CDK1-positive組整體生存趨勢較CDK1-negative組差。見圖2d～f。
在CDK1 mRNA表達水平層面，Kaplan-Meier生存分析示，TCGA數據庫和GSE66743數據集中的肉瘤、MPNST患者CDK1高表達組生存時間與低表達組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。在TCGA的263例肉瘤數據中，共有259例肉瘤患者有生存數據，CDK1 mRNA高表達組（n=130）和低表達組（n=129）中位總生存期分別為4.75年和6.75年，差異有統計學意義（P<0.05）。GSE66743數據集中29例MPNST患者CDK1 mRNA高表達組（n=16）與低表達組（n=13）中位總生存期分別為19 個月和NA，差異有統計學意義（P<0.05）。263例肉瘤患者樣本中包含9例MPNST樣本（CDK1高表達組n=5，低表達組n=4），Kaplan-Meier生存分析示差異無統計學意義（P>0.05），可能與樣本量較小有關，但生存曲線整體趨勢仍顯示CDK1高表達組患者預后較差。見圖2g～i。
2.4 CDK1和其他CDK家族在MPNST中表達特點
與NF和PNF組織相比，CDK1 mRNA的表達在MPNST患者中顯著上調 ［GSE66743、GSE145064數據集（P<0.05）］。GSE66743數據集中CDK2 mRNA在MPNST和NF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；GSE66743、GSE145064數據集中CDK3 mRNA在MPNST與NF及PNF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；TCGA數據庫中CDK4 mRNA在肉瘤組織與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；GSE145064數據集中CDK5 mRNA在MPNST與PNF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05），TCGA數據庫中CDK5 mRNA在肉瘤與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；GSE145064數據集、GSE66743數據集和TCGA數據庫中CDK6 mRNA在MPNST與NF、PNF組織中表達差異無統計學意義（P>0.05），在肉瘤與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064數據集中CDK7 mRNA在MPNST與正常、NF、PNF組織中表達差異均無統計學意義（P>0.05），在肉瘤與正常組織中表達差異無統計學意義（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064數據集中CDK8 mRNA在MPNST與正常、NF、PNF組織中表達差異均無統計學意義（P>0.05），在肉瘤組織中表達低于正常組織，但差異無統計學意義（P>0.05）。因此，在轉錄組水平上，CDK家族成員中只有CDK1在MPNST中表達與正常組織、NF組織和PNF組織差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3、4。
圖3
CDK1～4 mRNA在各組織中的表達情況 *P<0.05
a. GSE66743數據集中CDK1 mRNA表達；b. GSE145064數據集中CDK1 mRNA表達；c～f. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中CDK2 mRNA表達；g～i. Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中CDK3 mRNA表達；j～m. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中CDK4 mRNA表達
Figure3. Expression of CDK1-4 mRNA in various tissues *P<0.05a. Expression of CDK1 mRNA in the GSE66743 dataset; b. Expression of CDK1 mRNA in the GSE145064 dataset; c-f. Expression of CDK2 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; g-i. Expression of CDK3 mRNA in the Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; j-m. Expression of CDK4 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets
圖4
CDK5～8 mRNA在各組織中的表達情況 *P<0.05
從左至右依次為TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064數據集中 a. CDK5 mRNA；b. CDK6 mRNA；c. CDK7 mRNA；d. CDK8 mRNA
Figure4. Expression of CDK5-8 mRNA in various tissues *P<0.05From left to right for TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets, respectively a. CDK5 mRNA; b. CDK6 mRNA; c. CDK7 mRNA; d. CDK8 mRNA
3 討論
CDK1蛋白是細胞周期調控的關鍵酶，本研究進一步表明其在MPNST中扮演著重要角色。既往研究表明，CDK1在諸多瘤種中的高表達與腫瘤的快速增殖、侵襲性增高和較差的預后密切相關[2，7-10]。基于轉錄組測序和生物信息學分析，我們發現CDK1在MPNST腫瘤樣本中的轉錄水平顯著高于正常組織，這一發現得到了公共數據集的支持。CDK1的異常高表達通常伴隨著腫瘤細胞增殖加速和惡性行為的增強。本研究進一步行生存分析顯示，存在CDK1轉錄上調的MPNST患者其生存時間顯著低于低表達組，MPNST組織中CDK1蛋白表達陽性患者生存趨勢較表達陰性患者差。提示CDK1可能是影響MPNST患者預后的重要因素。這些研究結果不僅揭示了CDK1在MPNST中的關鍵作用，還表明其表達水平可以作為評估MPNST患者預后的潛在生物標志物。
CDK1在多個瘤種中被證實是參與腫瘤發生、發展的關鍵因子。研究表明[9，11]，CDK1高表達與胰腺導管細胞癌患者較差的預后相關，靶向CDK1能夠通過誘導G2/M期阻滯、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤干細胞等方式治療胰腺導管細胞癌。本研究結果顯示CDK1 mRNA在MPNST中的轉錄上調與較差的預后相關，且相較于其他CDK家族成員，CDK1在MPNST中表現出獨特的表達模式。我們分析CDK1可能是MPNST發生、發展過程中的關鍵分子，CDK1作為MPNST潛在的治療靶點具有良好研究前景。
CDK1是如何影響MPNST發生、發展的具體機制目前仍未明確。Xu等[12]的研究表明，CDK1表達水平與胰腺導管細胞癌預后相關，敲低CDK1表達會導致胰腺癌細胞腫瘤干性降低并使腫瘤干細胞亞群減少，具體機制是通過調節CDK1的翻譯后修飾，即減少組蛋白去乙酰化酶介導的CDK1去乙酰化，從而減少STAT3的磷酸化來實現的。此外，富含絲氨酸/精氨酸剪接因子9（SRSF9）、癌高甲基化因子1（HIC1）、丙酮酸激酶同工酶M2型（PKM2）、長鏈酰基輔酶A合酶 4 （ASCL-4）、去泛素化酶YOD1等因子也在膠質瘤、膠質母細胞瘤、結直腸癌和三陰性乳腺癌中分別通過不同途徑來調控CDK1表達，進而影響細胞周期進程來影響腫瘤細胞增殖能力、耐藥性等[13-17]。基于上述研究結果， CDK1上下游相關分子也可能通過直接與CDK1啟動子區域結合、表觀遺傳修飾、減少鐵死亡等途徑調控MPNST細胞惡性增殖。CDK1的這些多重作用機制揭示了其在MPNST發生和進展中的核心地位，表明其異常活性可能是導致MPNST細胞逃避正常細胞周期控制和加速腫瘤發展的關鍵因素。
本研究結果表明，CDK家族中僅有CDK1在MPNST中的轉錄相較于正常組織、NF組織和PNF組織均上調，然而本次組織微陣列中免疫組織化學染色陽性表達CDK1蛋白的患者較少，與CDK1 mRNA在MPNST組織中的高表達存在明顯差異。我們分析這種差異是由于CDK1蛋白上、下游存在潛在調節機制亦或是免疫組織化學染色操作等原因造成的。在今后的研究中，我們將重點就CDK1 mRNA的表觀遺傳修飾以及CDK1蛋白的翻譯后修飾進行研究，探尋CDK1 mRNA和蛋白上、下游的具體調節機制。同時，細胞周期的調控復雜多樣，無法忽視其他CDK家族成員分子以及細胞周期調節因子和CDK1蛋白之間的相互作用關系。不僅CDK1蛋白受到WEE1樣蛋白激酶、細胞分裂周期因子（CDC25）等分子對其的磷酸化/去磷酸化調控，研究表明，CDK7也能發揮CDK激酶（CAK）活性磷酸化包含CDK1在內的幾種CDK成員[18-19]。因此，其他CDK分子以及參與細胞周期調控因子與CDK1之間的相互作用同樣不能被忽略，這也是需要進一步探索研究的關鍵之一。
鑒于CDK1在MPNST中的關鍵作用，針對CDK1的抑制成為一種具有潛力的治療策略。初步研究顯示，CDK1抑制劑能夠有效阻止MPNST細胞的增殖，并誘導腫瘤細胞凋亡[20]。這些發現為開發新的MPNST治療方法提供了重要依據。未來研究需要進一步優化CDK1抑制劑的設計，提升其選擇性和效力，同時評估其在臨床應用中的安全性和有效性。此外，結合現有的化療和放療手段，CDK1抑制劑有望增強治療效果，提高患者生存率。值得注意的是，CDK1不僅在MPNST中表現出關鍵作用，在多種惡性腫瘤中也顯示出相似的機制和潛力。因此，針對CDK1的治療策略不僅可能為MPNST患者帶來新的希望，也有望為其他癌癥的治療提供新思路。通過深入研究CDK1在MPNST中的具體作用機制和其作為治療靶點的潛力，我們期待未來能夠開發出更加精準和有效的治療方案，顯著改善MPNST患者預后，并拓展這一策略在其他腫瘤中的應用。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經天津市腫瘤醫院（核）醫學倫理委員會批準（bc2023111）；患者均簽署知情同意書
作者貢獻聲明 劉源欣：免疫組織化學染色、作圖、文章撰寫 ；付來華：數據統計分析、臨床資料收集整理；劉昊天：研究設計、數據統計分析、作圖；張耕溥、肖婉祎：臨床資料收集整理；高梓唯、張洪亮：數據統計分析；楊吉龍：研究指導、論文審閱、實驗設計、經費支持
