引用本文： 王會新, 李倩, 侯曉雯, 史新竹, 馮旭. 肺腺癌ceRNA調控網絡構建及AFAP1-AS1功能驗證. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2024, 31(4): 576-584. doi: 10.7507/1007-4848.202207067 復制
肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一（占所有癌癥的12.3%），死亡率亦居第一位，肺癌患者平均5年生存率為15%[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細胞肺癌最常見的類型，約占病例的40% [2]。盡管近年來在診斷和治療方面取得了進展，但LUAD患者的總生存率仍然不盡人意。因此，尋找新的LUAD治療策略已成為當前研究熱點。近年來，高通量測序技術和生物信息學分析方法不斷完善，開辟了研究LUAD的新思路和新方法。
在過去的幾十年中，蛋白質編碼基因在肺癌中得到了廣泛的研究，但人類基因組轉錄的蛋白質編碼基因不到2%，大約85%是非編碼RNA，其中包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[3]。LncRNA是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，具有明顯表達的細胞或組織特異性，其可在多層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）調控基因的表達[4]。LncRNA最初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，是一種“噪音”，不具有生物學功能[5]。然而，近年來的研究[6]表明，lncRNA在LUAD中的表達水平與癌旁組織存在顯著差異，提示lncRNA可能影響腫瘤發生發展。進一步研究[7-9]發現，lncRNA通過參與包括染色質修飾、基因表達調控、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸、細胞分化等在內的多種細胞學進程，影響腫瘤轉移與侵襲、腫瘤細胞的增殖和凋亡、腫瘤血管生成及調節腫瘤耐藥，促進或抑制LUAD的發生發展，為LUAD治療提供新策略。大量研究[10]表明，lncRNA可以吸附多個miRNA，而每個miRNA又有多個下游靶基因結合，形成了一個十分復雜的lncRNA的調控網絡，成為ceRNA，從而影響和調節mRNA的表達。這些lncRNA介導的ceRNA在理論上與癌癥的發生發展密切相關。因此，揭示LUAD轉移新機制并尋找新的治療靶點對LUAD患者具有重要作用。在本研究中，通過基因表達綜合性基因庫（Gene Expression Omnibus，GEO）篩選LUAD患者中lncRNA和mRNA的微陣列基因表達芯片，篩選出差異表達基因，構建ceRNA網絡，為LUAD的診斷、治療和預后提供新的生物標志物。
1 材料與方法
1.1 數據來源
GEO是美國國家生物技術信息中心（NCBI）公開提供的基因組學數據庫，提供了大量LUAD的基因組數據。數據集篩選的納入標準：（1）關于LUAD的研究；（2）組織樣本包括腫瘤和相應的鄰近組織或正常組織；（3）總樣本數≥40個；（4）數據集必須包括lncRNA和mRNA。
1.2 肺腺癌中的差異表達基因
通過GEO2R分析數據集的基因表達譜得到差異表達的lncRNA和mRNA，篩選條件為 |LogFC|>1.5和校正后的P值<0.05。將分析得到的差異表達基因通過韋恩圖取交集，得到交集的mRNA和lncRNA。
1.3 構建ceRNA網絡
根據篩選出來的lncRNA，應用lncRNA-mRNA在線數據庫miRcode預測與其相互作用的靶miRNA，應用miRNA靶基因預測數據庫（miRDB、miTarBase和Targetscan）預測靶mRNA。取3個數據庫的交集，然后將交集出的mRNA與GEO篩選出的LUAD差異表達基因取交集。基于上述條件篩選出lncRNA、miRNA及mRNA，采用Cytoscape V3.8.2構建ceRNA網絡。
1.4 構建蛋白質相互作用網絡
蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析是發現基于蛋白質網絡的不同模塊的LUAD相關差異表達基因的重要工具。構建PPI網絡以鑒定與無腫瘤組織相比在LUAD中的關鍵編碼基因和重要基因模塊。使用String數據庫構建PPI網絡，并使用Cytoscape V3.8.2進行可視化。
1.5 功能富集分析
通過預測ceRNA網絡中mRNA的相關生物學功能和通路，從而對網絡中共表達lncRNA的功能進行推斷分析。利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）在線工具對所得的55個mRNA進行功能富集分析，基因本體論數據庫（Gene Ontology，GO，包括分子功能、細胞成分和生物學過程）以及基因和基因組的京都百科全書數據庫（KEGG）用于闡明差異表達基因在ceRNA網絡中的潛在作用。
1.6 細胞培養和轉染
細胞系選擇A549細胞和MRC-5細胞（Procell）。并用RPMI-1640（Sigma-Aldrich，Whitehouse Station，New Jersey）培養基培養，其中含有10%的胎牛血清（FBS，Gibco，Carlsbad，California）。為了沉默肌動蛋白纖維相關蛋白 1-反義 RNA1（actinfilament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1）的表達，在細胞處于對數生長期時，并且細胞融合率為70%～80%的情況下進行轉染。siRNA由金拓思設計并合成（表1）。轉染載體和脂質體6000（Beyotime Biotechnology，China）用Opti-MEM稀釋。混合并孵育20 min后，將細胞置于每個孔中。
表1
AFAP1-AS1的siRNA引物序列
1.7 反轉錄定量聚合酶鏈式反應
從A549細胞和MRC-5細胞中提取總RNA，用NanoDrop2000分光光度分析儀定量。用Prime Script RT試劑將總RNA逆轉錄成互補的脫氧核糖核酸（cDNA）。利用SYBR Premiex ExTaq進行定量PCR擴增獲得的cDNA。采用2-??Ct法對相對水平進行定量分析。以甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參比（表2）。
表2
qPCR的引物設計
1.8 細胞增殖實驗
將細胞接種于96孔板中，每孔接種2.0×103個細胞，分別用0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL和2.5 mg/mL RPMI-1640培養液孵育。每個實驗重復進行3次。用CCK8試劑盒記錄450 nm處的吸光度，繪制活性曲線。分別于第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d測定細胞活力。
1.9 細胞劃痕實驗
將細胞接種于6孔板中，加入5.0×104細胞/孔并孵育。并在6孔板上畫一條直線。用PBS洗滌脫落的細胞。分別在0 h和48 h時觀察細胞的劃痕寬度（n=5）。
1.10 細胞侵襲實驗
在侵襲實驗中，將4.0×104個細胞添加到覆蓋基質凝膠的上部腔室Transwell膜的頂部。在底井中加入一個完整的培養基以刺激入侵。然后將細胞在37℃下孵育48 h。去除上室的細胞，下室的細胞用20%甲醇固定（5 min），用0.1%結晶紫（n=5）染色。然后在倒置顯微鏡下觀察并計數染色細胞，隨機選取5個不同的顯微鏡視圖進行分析，包括不同的倍數。
1.11 細胞凋亡實驗
采用AnnexinV-PI細胞凋亡檢測試劑盒，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。用siRNA處理細胞48 h。然后收集細胞，按照說明用AnnexinV-PI染色。雙染色后，用流式細胞術檢測早期和晚期凋亡細胞。
1.12 統計學分析
采用SPSS 22.0軟件對數據進行分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）描述，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。P≤0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 肺腺癌中的差異表達基因
從GEO數據庫下載了基因表達微陣列數據集GSE27262（25個正常組織和25個LUAD組織）和GSE19804（60個正常組織和60個LUAD組織）。為了避免不同平臺帶來的偏倚，2個數據集選擇同一平臺GPL570。
從GSE27262數據集中，總共獲得1051個差異表達的mRNA（358個上調和693個下調的mRNA）和19個差異表達的lncRNA（9個上調和10個下調的lncRNA）。
從GSE19804數據集中，總共獲得510個差異表達的mRNA（129個上調和381個下調的mRNA）和6個差異表達的lncRNA（3個上調和3個下調的lncRNA）（圖1）。
圖1
在肺腺癌組織和癌旁組織中鑒定差異表達基因
a：GSE19804差異表達；b：GSE27262差異表達的基因；紅色代表上調的基因，藍色代表下調的基因
韋恩圖顯示了差異表達的mRNA和差異表達的lncRNA的交集，共有494個差異表達的mRNA和6個差異表達的lncRNA（圖2）。
圖2
差異表達基因的韋恩圖
a：GSE27262和GSE19804中差異表達的mRNA的交集基因數；b：GSE27262和GSE19804中差異表達的lncRNA的交集基因數
2.2 ceRNA網絡的構建
根據上述lncRNA，miRNA和mRNA之間的相互作用，共有6個lncRNA與22個miRNA之間相互作用（表3），22個miRNA與55個mRNA之間相互作用（表4）。最后，LUAD特異的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調控網絡，包含83個節點和155個邊緣。使用Cytoscape進行可視化，得到lncRNA介導的ceRNA網絡（圖3）。
圖3
在肺腺癌中構建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網絡
綠色圓形節點代表mRNA，藍色矩形代表miRNA，粉色菱形代表lncRNA
表3
ceRNA網絡中lncRNA的靶向miRNA
表4
ceRNA網絡中miRNA的靶向mRNA
2.3 GO和KEGG途徑富集分析
GO和KEGG通路富集分析發現，參與ceRNA網絡的mRNA與37種生物過程（biological process，BP）顯著相關，其中主要包括MAPK活性激活、蛋白激酶B信號血管生成的正調控、細胞增殖負調控等；mRNA與6種分子功能（molecular function，MF）顯著相關，分別為：肝素結合、信號蛋白受體結合、化學驅避活性、SMAD結合、生長因子活性、受體結合；與5種細胞組分（cellular component，CC）顯著相關，即胞外區、質膜外側、細胞外間隙、質膜的組成部分、蛋白質細胞外基質。ceRNA網絡相關基因在3個KEGG途徑中顯著富集，即調節干細胞多能性的信號通路、TGF-β信號通路和蛋白質消化和吸收。富集分析表明，通過調節這些生物學過程和途徑，LUAD特異的ceRNA網絡可能參與了腫瘤過程（圖4）。此外，為鑒定ceRNA網絡中mRNA蛋白質之間的相互作用，構建了PPI網絡。我們發現一些綜合評分較高的基因，包括FGF2、COL1A2，BMP2、KLF4、CXCL5和MMP11，主要在“TGF-β信號通路”途徑中富集（圖5）。
圖4
ceRNA網絡中mRNA的GO和KEGG富集分析
a：CC的氣泡圖；b：MF的氣泡圖；c：BP的氣泡圖；d：KEGG的氣泡圖；BP：生物過程；CC：細胞組分；MF：分子功能
圖5
在ceRNA網絡中mRNA的PPI網絡
圓圈代表基因，線條代表基因編碼的蛋白質之間的相互作用
2.4 AFAP1-AS1在肺腺癌細胞中的表達
AFAP1-AS1在A549細胞中的表達量為1.37±0.15。MRC-5的表達水平為0.57±0.13。AFAP1-AS1在A549中表達量更高。
2.5 siRNA的轉染
AFAP1-AS1在siRNA-NC、siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3組中的表達量分別為1.23±0.11、0.55±0.09、0.31±0.04和0.44±0.02（F=90.05，P<0.001）。與siRNA-NC組相比，siRNA-2組中AFAP1-AS1的表達明顯降低。
2.6 沉默AFAP1-AS1抑制腫瘤生長
通過CCK8實驗發現，在第4 d和第5 d，沉默的AFAP1-AS1的生長速率顯著低于對照組，差異有統計學意義（圖6）。
圖6
轉染siRNA-NC和siRNA-2的A549細胞增殖情況
*：
2.7 沉默AFAP1-AS1抑制細胞遷移和細胞侵襲
通過細胞遷移實驗檢測AFAP1-AS1對LUAD細胞遷移能力的影響。在A549細胞系中，AFAP1-AS1 siRNA-2組的細胞遷移數量明顯低于對照組（圖7）。
圖7
轉染siRNA-NC和siRNA-2后A549細胞的遷移能力評價（×10）
Transwell實驗檢測AFAP1-AS1對LUAD細胞侵襲的下調。下調AFAP1-AS1后的細胞侵襲次數低于對照組（圖8）。
圖8
siRNA-2和siRNA-NC轉染A549細胞的侵襲能力（×10）及直條圖
*：
2.8 沉默AFAP1-AS1促進細胞凋亡
流式細胞術檢測AFAP1-AS1下調后LUAD細胞凋亡的結果顯示，抑制AFAP1-AS1顯著增加了A549的凋亡，差異有統計學意義（圖9）。
圖9
siRNA-2和siRNA-NC轉染A549細胞后的細胞凋亡能力
3 討論
LUAD是最常見的非小細胞肺癌組織學類型，每年在全球造成約50萬例死亡。盡管在揭示LUAD的機制方面取得了重大進展，但確切的發病機制仍不完全了解，因此確定用于診斷和治療LUAD患者的特定生物標志物已成為當務之急。越來越多的研究[11-12]表明，lncRNA通過多種途徑促進腫瘤發生和發展。2011年Salmena等[13]首次提出ceRNA假說，在該假說中，lncRNA可作為ceRNA，通過競爭共享的miRNA來調控惡性腫瘤中的基因表達，其揭示了lncRNA-miRNA-mRNA調控相互作用的新概念，為深入了解各種疾病，特別是癌癥的機制提供了依據。如H19誘導miR-675-5p上調，而P53的水平則顯著下調，P53被鑒定為miR-675的靶基因，因此，H19的高表達通過調控miR-675-5p縮短LUAD患者的生存時間[14]。此外，LINC00355和LINC00466可以分別通過海綿作用miR-195和miR-144靶向CCNE1和HOXA10，從而促進LUAD的進展[15-16]。然而，對LUAD中lncRNA介導的ceRNA網絡的全基因組篩選仍然缺乏。
在本研究中，我們從GEO數據庫獲得微陣列數據集，使用生物信息學分析來挖掘LUAD相關具有差異表達的lncRNA和mRNA。通過構建lncRNA-miRNA-mRNA網絡，總共鑒定了6個lncRNA，22個miRNA和55個mRNA，其中包括83個節點和155個邊緣。GO富集分析的結果表明，與ceRNA相關的RNA主要參與癌癥相關的生物學過程，例如DNA轉錄正調控，信號蛋白受體結合和細胞外間隙。此外，參與ceRNA網絡的mRNA在3個KEGG途徑（調節干細胞多能性的信號通路、TGF-β信號通路、蛋白質消化和吸收）中顯著豐富。富集結果表明，ceRNA網絡可能調節LUAD的生物學過程和途徑。
在參與ceRNA網絡中的lncRNA，AFAP1-AS1基因位于人類第4號染色體的反義鏈上，在哺乳動物的發育中起著至關重要的作用[17]。AFAP1-AS1已被描述為多種癌癥的致癌基因，包括胃癌、結直腸癌、肝癌和肺癌[18]。AFAP1-AS1作為胃癌的生物標記物，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并作為ceRNA通過海綿體miR-205-5p靶向AFPA1[19]。越來越多的研究證明lncRNA在結直腸癌中具有重要的調節作用。Tang等[20]的研究發現AFAP1-AS1促進結直腸癌的發生，并且在結直腸癌組織中表達上調，可能是結直腸癌一種新的預后分子。AFAP1-AS1的高表達是LUAD患者預后不良的獨立危險因素，可通過調節miR-545-3p/肝癌源性生長因子軸[21-22]促進LUAD細胞凋亡。通過生物信息學預測發現，AFAP1-AS1在LUAD中上調，但相關研究較少。因此，我們特別關注了差異表達基因AFAP1-AS1在LUAD中的生物學功能。為了檢測AFAP1-AS1的生物學功能，本研究設計了siRNA，可以有效地沉默AFAP1-AS1在A549細胞中的表達。AFAP1-AS1在LUAD細胞中的表達明顯高于正常肺細胞。如預測的那樣，AFAP1-AS1的沉默抑制了LUAD細胞的增殖，抑制細胞遷移能力，降低細胞侵襲能力，但促進細胞凋亡。這些結果表明，AFAP1-AS1可能作為一種促癌基因，在LUAD中發揮重要作用。
近年來，關于癌癥靶向治療的研究越來越多，相信也會有更多的靶標位點被人類發現。這預示著靶標治療在不久的將來可能會應用于多種腫瘤的臨床治療。
本研究構建了一個lncRNA介導的ceRNA網絡，這可能有助于進一步研究LUAD的作用機制。此外，通過細胞實驗，本研究發現AFAP1-AS1有潛力作為LUAD的治療靶點。
利益沖突：無。
作者貢獻：王會新負責論文設計、撰寫與修改，數據整理分析；李倩、馮旭參與選題，負責論文審閱與修改；侯曉雯、史新竹和馮旭負責對文章的知識性內容作批判性審閱。
肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一（占所有癌癥的12.3%），死亡率亦居第一位，肺癌患者平均5年生存率為15%[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細胞肺癌最常見的類型，約占病例的40% [2]。盡管近年來在診斷和治療方面取得了進展，但LUAD患者的總生存率仍然不盡人意。因此，尋找新的LUAD治療策略已成為當前研究熱點。近年來，高通量測序技術和生物信息學分析方法不斷完善，開辟了研究LUAD的新思路和新方法。
在過去的幾十年中，蛋白質編碼基因在肺癌中得到了廣泛的研究，但人類基因組轉錄的蛋白質編碼基因不到2%，大約85%是非編碼RNA，其中包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[3]。LncRNA是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，具有明顯表達的細胞或組織特異性，其可在多層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）調控基因的表達[4]。LncRNA最初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，是一種“噪音”，不具有生物學功能[5]。然而，近年來的研究[6]表明，lncRNA在LUAD中的表達水平與癌旁組織存在顯著差異，提示lncRNA可能影響腫瘤發生發展。進一步研究[7-9]發現，lncRNA通過參與包括染色質修飾、基因表達調控、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸、細胞分化等在內的多種細胞學進程，影響腫瘤轉移與侵襲、腫瘤細胞的增殖和凋亡、腫瘤血管生成及調節腫瘤耐藥，促進或抑制LUAD的發生發展，為LUAD治療提供新策略。大量研究[10]表明，lncRNA可以吸附多個miRNA，而每個miRNA又有多個下游靶基因結合，形成了一個十分復雜的lncRNA的調控網絡，成為ceRNA，從而影響和調節mRNA的表達。這些lncRNA介導的ceRNA在理論上與癌癥的發生發展密切相關。因此，揭示LUAD轉移新機制并尋找新的治療靶點對LUAD患者具有重要作用。在本研究中，通過基因表達綜合性基因庫（Gene Expression Omnibus，GEO）篩選LUAD患者中lncRNA和mRNA的微陣列基因表達芯片，篩選出差異表達基因，構建ceRNA網絡，為LUAD的診斷、治療和預后提供新的生物標志物。
1 材料與方法
1.1 數據來源
GEO是美國國家生物技術信息中心（NCBI）公開提供的基因組學數據庫，提供了大量LUAD的基因組數據。數據集篩選的納入標準：（1）關于LUAD的研究；（2）組織樣本包括腫瘤和相應的鄰近組織或正常組織；（3）總樣本數≥40個；（4）數據集必須包括lncRNA和mRNA。
1.2 肺腺癌中的差異表達基因
通過GEO2R分析數據集的基因表達譜得到差異表達的lncRNA和mRNA，篩選條件為 |LogFC|>1.5和校正后的P值<0.05。將分析得到的差異表達基因通過韋恩圖取交集，得到交集的mRNA和lncRNA。
1.3 構建ceRNA網絡
根據篩選出來的lncRNA，應用lncRNA-mRNA在線數據庫miRcode預測與其相互作用的靶miRNA，應用miRNA靶基因預測數據庫（miRDB、miTarBase和Targetscan）預測靶mRNA。取3個數據庫的交集，然后將交集出的mRNA與GEO篩選出的LUAD差異表達基因取交集。基于上述條件篩選出lncRNA、miRNA及mRNA，采用Cytoscape V3.8.2構建ceRNA網絡。
1.4 構建蛋白質相互作用網絡
蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析是發現基于蛋白質網絡的不同模塊的LUAD相關差異表達基因的重要工具。構建PPI網絡以鑒定與無腫瘤組織相比在LUAD中的關鍵編碼基因和重要基因模塊。使用String數據庫構建PPI網絡，并使用Cytoscape V3.8.2進行可視化。
1.5 功能富集分析
通過預測ceRNA網絡中mRNA的相關生物學功能和通路，從而對網絡中共表達lncRNA的功能進行推斷分析。利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）在線工具對所得的55個mRNA進行功能富集分析，基因本體論數據庫（Gene Ontology，GO，包括分子功能、細胞成分和生物學過程）以及基因和基因組的京都百科全書數據庫（KEGG）用于闡明差異表達基因在ceRNA網絡中的潛在作用。
1.6 細胞培養和轉染
細胞系選擇A549細胞和MRC-5細胞（Procell）。并用RPMI-1640（Sigma-Aldrich，Whitehouse Station，New Jersey）培養基培養，其中含有10%的胎牛血清（FBS，Gibco，Carlsbad，California）。為了沉默肌動蛋白纖維相關蛋白 1-反義 RNA1（actinfilament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1）的表達，在細胞處于對數生長期時，并且細胞融合率為70%～80%的情況下進行轉染。siRNA由金拓思設計并合成（表1）。轉染載體和脂質體6000（Beyotime Biotechnology，China）用Opti-MEM稀釋。混合并孵育20 min后，將細胞置于每個孔中。
表1
AFAP1-AS1的siRNA引物序列
1.7 反轉錄定量聚合酶鏈式反應
從A549細胞和MRC-5細胞中提取總RNA，用NanoDrop2000分光光度分析儀定量。用Prime Script RT試劑將總RNA逆轉錄成互補的脫氧核糖核酸（cDNA）。利用SYBR Premiex ExTaq進行定量PCR擴增獲得的cDNA。采用2-??Ct法對相對水平進行定量分析。以甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參比（表2）。
表2
qPCR的引物設計
1.8 細胞增殖實驗
將細胞接種于96孔板中，每孔接種2.0×103個細胞，分別用0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL和2.5 mg/mL RPMI-1640培養液孵育。每個實驗重復進行3次。用CCK8試劑盒記錄450 nm處的吸光度，繪制活性曲線。分別于第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d測定細胞活力。
1.9 細胞劃痕實驗
將細胞接種于6孔板中，加入5.0×104細胞/孔并孵育。并在6孔板上畫一條直線。用PBS洗滌脫落的細胞。分別在0 h和48 h時觀察細胞的劃痕寬度（n=5）。
1.10 細胞侵襲實驗
在侵襲實驗中，將4.0×104個細胞添加到覆蓋基質凝膠的上部腔室Transwell膜的頂部。在底井中加入一個完整的培養基以刺激入侵。然后將細胞在37℃下孵育48 h。去除上室的細胞，下室的細胞用20%甲醇固定（5 min），用0.1%結晶紫（n=5）染色。然后在倒置顯微鏡下觀察并計數染色細胞，隨機選取5個不同的顯微鏡視圖進行分析，包括不同的倍數。
1.11 細胞凋亡實驗
采用AnnexinV-PI細胞凋亡檢測試劑盒，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。用siRNA處理細胞48 h。然后收集細胞，按照說明用AnnexinV-PI染色。雙染色后，用流式細胞術檢測早期和晚期凋亡細胞。
1.12 統計學分析
采用SPSS 22.0軟件對數據進行分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）描述，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。P≤0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 肺腺癌中的差異表達基因
從GEO數據庫下載了基因表達微陣列數據集GSE27262（25個正常組織和25個LUAD組織）和GSE19804（60個正常組織和60個LUAD組織）。為了避免不同平臺帶來的偏倚，2個數據集選擇同一平臺GPL570。
從GSE27262數據集中，總共獲得1051個差異表達的mRNA（358個上調和693個下調的mRNA）和19個差異表達的lncRNA（9個上調和10個下調的lncRNA）。
從GSE19804數據集中，總共獲得510個差異表達的mRNA（129個上調和381個下調的mRNA）和6個差異表達的lncRNA（3個上調和3個下調的lncRNA）（圖1）。
圖1
在肺腺癌組織和癌旁組織中鑒定差異表達基因
a：GSE19804差異表達；b：GSE27262差異表達的基因；紅色代表上調的基因，藍色代表下調的基因
韋恩圖顯示了差異表達的mRNA和差異表達的lncRNA的交集，共有494個差異表達的mRNA和6個差異表達的lncRNA（圖2）。
圖2
差異表達基因的韋恩圖
a：GSE27262和GSE19804中差異表達的mRNA的交集基因數；b：GSE27262和GSE19804中差異表達的lncRNA的交集基因數
2.2 ceRNA網絡的構建
根據上述lncRNA，miRNA和mRNA之間的相互作用，共有6個lncRNA與22個miRNA之間相互作用（表3），22個miRNA與55個mRNA之間相互作用（表4）。最后，LUAD特異的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調控網絡，包含83個節點和155個邊緣。使用Cytoscape進行可視化，得到lncRNA介導的ceRNA網絡（圖3）。
圖3
在肺腺癌中構建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網絡
綠色圓形節點代表mRNA，藍色矩形代表miRNA，粉色菱形代表lncRNA
表3
ceRNA網絡中lncRNA的靶向miRNA
表4
ceRNA網絡中miRNA的靶向mRNA
2.3 GO和KEGG途徑富集分析
GO和KEGG通路富集分析發現，參與ceRNA網絡的mRNA與37種生物過程（biological process，BP）顯著相關，其中主要包括MAPK活性激活、蛋白激酶B信號血管生成的正調控、細胞增殖負調控等；mRNA與6種分子功能（molecular function，MF）顯著相關，分別為：肝素結合、信號蛋白受體結合、化學驅避活性、SMAD結合、生長因子活性、受體結合；與5種細胞組分（cellular component，CC）顯著相關，即胞外區、質膜外側、細胞外間隙、質膜的組成部分、蛋白質細胞外基質。ceRNA網絡相關基因在3個KEGG途徑中顯著富集，即調節干細胞多能性的信號通路、TGF-β信號通路和蛋白質消化和吸收。富集分析表明，通過調節這些生物學過程和途徑，LUAD特異的ceRNA網絡可能參與了腫瘤過程（圖4）。此外，為鑒定ceRNA網絡中mRNA蛋白質之間的相互作用，構建了PPI網絡。我們發現一些綜合評分較高的基因，包括FGF2、COL1A2，BMP2、KLF4、CXCL5和MMP11，主要在“TGF-β信號通路”途徑中富集（圖5）。
圖4
ceRNA網絡中mRNA的GO和KEGG富集分析
a：CC的氣泡圖；b：MF的氣泡圖；c：BP的氣泡圖；d：KEGG的氣泡圖；BP：生物過程；CC：細胞組分；MF：分子功能
圖5
在ceRNA網絡中mRNA的PPI網絡
圓圈代表基因，線條代表基因編碼的蛋白質之間的相互作用
2.4 AFAP1-AS1在肺腺癌細胞中的表達
AFAP1-AS1在A549細胞中的表達量為1.37±0.15。MRC-5的表達水平為0.57±0.13。AFAP1-AS1在A549中表達量更高。
2.5 siRNA的轉染
AFAP1-AS1在siRNA-NC、siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3組中的表達量分別為1.23±0.11、0.55±0.09、0.31±0.04和0.44±0.02（F=90.05，P<0.001）。與siRNA-NC組相比，siRNA-2組中AFAP1-AS1的表達明顯降低。
2.6 沉默AFAP1-AS1抑制腫瘤生長
通過CCK8實驗發現，在第4 d和第5 d，沉默的AFAP1-AS1的生長速率顯著低于對照組，差異有統計學意義（圖6）。
圖6
轉染siRNA-NC和siRNA-2的A549細胞增殖情況
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2.7 沉默AFAP1-AS1抑制細胞遷移和細胞侵襲
通過細胞遷移實驗檢測AFAP1-AS1對LUAD細胞遷移能力的影響。在A549細胞系中，AFAP1-AS1 siRNA-2組的細胞遷移數量明顯低于對照組（圖7）。
圖7
轉染siRNA-NC和siRNA-2后A549細胞的遷移能力評價（×10）
Transwell實驗檢測AFAP1-AS1對LUAD細胞侵襲的下調。下調AFAP1-AS1后的細胞侵襲次數低于對照組（圖8）。
圖8
siRNA-2和siRNA-NC轉染A549細胞的侵襲能力（×10）及直條圖
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2.8 沉默AFAP1-AS1促進細胞凋亡
流式細胞術檢測AFAP1-AS1下調后LUAD細胞凋亡的結果顯示，抑制AFAP1-AS1顯著增加了A549的凋亡，差異有統計學意義（圖9）。
圖9
siRNA-2和siRNA-NC轉染A549細胞后的細胞凋亡能力
3 討論
LUAD是最常見的非小細胞肺癌組織學類型，每年在全球造成約50萬例死亡。盡管在揭示LUAD的機制方面取得了重大進展，但確切的發病機制仍不完全了解，因此確定用于診斷和治療LUAD患者的特定生物標志物已成為當務之急。越來越多的研究[11-12]表明，lncRNA通過多種途徑促進腫瘤發生和發展。2011年Salmena等[13]首次提出ceRNA假說，在該假說中，lncRNA可作為ceRNA，通過競爭共享的miRNA來調控惡性腫瘤中的基因表達，其揭示了lncRNA-miRNA-mRNA調控相互作用的新概念，為深入了解各種疾病，特別是癌癥的機制提供了依據。如H19誘導miR-675-5p上調，而P53的水平則顯著下調，P53被鑒定為miR-675的靶基因，因此，H19的高表達通過調控miR-675-5p縮短LUAD患者的生存時間[14]。此外，LINC00355和LINC00466可以分別通過海綿作用miR-195和miR-144靶向CCNE1和HOXA10，從而促進LUAD的進展[15-16]。然而，對LUAD中lncRNA介導的ceRNA網絡的全基因組篩選仍然缺乏。
在本研究中，我們從GEO數據庫獲得微陣列數據集，使用生物信息學分析來挖掘LUAD相關具有差異表達的lncRNA和mRNA。通過構建lncRNA-miRNA-mRNA網絡，總共鑒定了6個lncRNA，22個miRNA和55個mRNA，其中包括83個節點和155個邊緣。GO富集分析的結果表明，與ceRNA相關的RNA主要參與癌癥相關的生物學過程，例如DNA轉錄正調控，信號蛋白受體結合和細胞外間隙。此外，參與ceRNA網絡的mRNA在3個KEGG途徑（調節干細胞多能性的信號通路、TGF-β信號通路、蛋白質消化和吸收）中顯著豐富。富集結果表明，ceRNA網絡可能調節LUAD的生物學過程和途徑。
在參與ceRNA網絡中的lncRNA，AFAP1-AS1基因位于人類第4號染色體的反義鏈上，在哺乳動物的發育中起著至關重要的作用[17]。AFAP1-AS1已被描述為多種癌癥的致癌基因，包括胃癌、結直腸癌、肝癌和肺癌[18]。AFAP1-AS1作為胃癌的生物標記物，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并作為ceRNA通過海綿體miR-205-5p靶向AFPA1[19]。越來越多的研究證明lncRNA在結直腸癌中具有重要的調節作用。Tang等[20]的研究發現AFAP1-AS1促進結直腸癌的發生，并且在結直腸癌組織中表達上調，可能是結直腸癌一種新的預后分子。AFAP1-AS1的高表達是LUAD患者預后不良的獨立危險因素，可通過調節miR-545-3p/肝癌源性生長因子軸[21-22]促進LUAD細胞凋亡。通過生物信息學預測發現，AFAP1-AS1在LUAD中上調，但相關研究較少。因此，我們特別關注了差異表達基因AFAP1-AS1在LUAD中的生物學功能。為了檢測AFAP1-AS1的生物學功能，本研究設計了siRNA，可以有效地沉默AFAP1-AS1在A549細胞中的表達。AFAP1-AS1在LUAD細胞中的表達明顯高于正常肺細胞。如預測的那樣，AFAP1-AS1的沉默抑制了LUAD細胞的增殖，抑制細胞遷移能力，降低細胞侵襲能力，但促進細胞凋亡。這些結果表明，AFAP1-AS1可能作為一種促癌基因，在LUAD中發揮重要作用。
近年來，關于癌癥靶向治療的研究越來越多，相信也會有更多的靶標位點被人類發現。這預示著靶標治療在不久的將來可能會應用于多種腫瘤的臨床治療。
本研究構建了一個lncRNA介導的ceRNA網絡，這可能有助于進一步研究LUAD的作用機制。此外，通過細胞實驗，本研究發現AFAP1-AS1有潛力作為LUAD的治療靶點。
利益沖突：無。
作者貢獻：王會新負責論文設計、撰寫與修改，數據整理分析；李倩、馮旭參與選題，負責論文審閱與修改；侯曉雯、史新竹和馮旭負責對文章的知識性內容作批判性審閱。
