剪切稀化是生物墨水的理想特性，因為其可減少堵塞的機會。對于基于擠出的生物打印，生物墨水在通過生物打印機時會經歷剪切力。剪切速率會隨著擠出速率的增加而增加，剪切稀化型生物墨水的表觀粘度會減小，這使得其更不容易堵塞，從而實現3D打印組織的結構保真度。組織氣管中復雜功能結構的制造需要生物墨水的精確逐層放置和凝固，剪切稀化型生物墨水或能滿足此要求。本綜述圍繞剪切稀化型生物墨水的機械性能重要性、分類和制備方法，同時列出其目前在3D打印組織氣管的應用現狀，討論該生物材料在組織氣管中的更多可能性與前景。
引用本文： 孫藝琪, 徐翔宇, 孫飛, 單一波, 沈志明, 史宏燦. 剪切稀化型生物墨水在3D生物打印組織氣管中的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2024, 31(12): 1859-1864. doi: 10.7507/1007-4848.202301039 復制
3D生物打印這些年來發展很快，已經成為器官缺損修復的研究熱點。其主要包括種子細胞、生物支架、生物因子和生物墨水等，其中生物墨水有至關重要的作用，是生物材料和生物單元用3D打印的手段制造出具有個性化的生物功能結構體，能夠滿足仿生形態學、生物體功能、細胞生長微環境等要求[1]。氣管是一種管狀結構，是下呼吸道起始段，是連接喉部和支氣管之間的管道。氣管是由上皮、基底膜、結締組織、平滑肌和軟骨層組成的復合管狀結構[2]。所以3D生物打印組織氣管中復雜功能結構的制造需要生物墨水的精確逐層放置和凝固，這一過程中，生物打印層需要保持其形狀及先前定義的3D結構，而打印過程中組織細胞會在活力和性能方面受到負面影響[3-5]，其中生物墨水的流變特性是解該決問題的重要點。生物打印中最常用的方法是通過打印頭將生物墨水擠出沉積到收集器上，同時將生物墨水快速相變為固體狀材料。這就需要生物墨水粘度足夠低，允許通過打印頭擠出，同時重新凝膠化的速度需要足夠快以保證在擠出后保持3D形狀[5]。由于這些要求，具有剪切變稀特性的生物墨水成為許多生物打印應用的焦點。當對材料施加高剪切應力時，剪切稀化型生物墨水顯示出低粘度，并且在剪切應力消除后恢復其原始粘度[6]。本文將對剪切稀化型生物墨水機械性能的重要性，該生物墨水的分類、制備方法和在3D打印組織氣管的應用現狀進行討論。
1 剪切稀化型生物墨水機械性能的重要性
理想的剪切稀化型生物墨水隨著剪切速率的增加而表現出低粘度，增加的剪切稀化行為證實了其可注射性，而不會在打印過程中堵塞噴嘴。基于這樣的特性，該生物墨水具有出色的印刷適性，形狀保真度和結構穩定性等機械性能，對生物打印性能和最終結構的剛性有很大的影響[7]。除此之外，機械應力對細胞存活和功能也有深遠的影響，所以這就要求生物墨水的機械性能能夠滿足人體細胞微環境的要求[8]。圍繞這一點，Fischer團隊在生物打印過程中精確控制了噴嘴部位的剪切應力，并研究了不同水平的剪切應力對人類間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）活力和增殖的影響[9]。結果發現，在剪切應力閾值下，載細胞可以進行生物打印而不會產生副作用。然而，高剪切應力會影響生物打印過程中MSCs的細胞活力，甚至會進一步誘導存活細胞增殖的長期改變。而剪切稀化型墨水主要是利用一些材料的表觀粘度隨剪切應力增加而減小的現象，在不受到剪切力時表現為凝膠態，當受到剪切力作用時變為溶膠態。因此，具有剪切稀化特性的生物墨水通常被使用在生物打印中，因為擠出過程中的低剪切應力有利于細胞存活和功能保留[10]。另外，Alblas團隊采用甲基丙烯酸化透明質酸（methacrylated hyaluronic acid ，MeHA）構成生物墨水對骨組織進行3D生物打印[11]。透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種天然多糖，但純HA的機械性能較差，導致結構支撐有限[12]。而進行聚合物化學改性后的MeHA顯示出更好的剪切稀化性能，便于3D生物打印，從而實現高分辨率印刷[13]。Alblas團隊發現僅基于MeHA生物墨水的機械性能誘導摻入的MSCs成骨分化，而無需額外的成骨刺激。摻入的細胞在培養21 d后顯示出約64.4%的活力，證明了MeHA的生物相容性。這也就證明剪切稀化型生物墨水在3D生物打印組織氣管領域中有良好的應用前景，因為其剪切稀化的特性不僅能夠促進氣管軟骨環的復雜精密結構的成型，同時也能夠提供相應的成骨刺激、提高印刷適性和細胞活性。
總之，所用生物墨水的機械性能對于3D結構的形成至關重要。機械性能不僅影響生物打印性能和最終結構的剛性，而且還直接影響細胞行為和活性，包括活力和分化[14]。
2 剪切稀化型生物墨水材料的分類
生物墨水材料中目前應用最廣泛、性能最突出的便是水凝膠和脫細胞細胞外基質（dECM）。水凝膠是一類具有良好親水性和3D網絡結構的軟質濕潤生物墨水材料，由于其結構和組成與天然細胞外基質（ECM）的相似性，在生物醫學工程領域引起了越來越多的關注。水凝膠具有高強度和可注射性[15-16]，通常分為天然型和合成型這兩種[17]，被認為是軟骨組織工程的承重組織和骨缺損治療的理想候選者，在3D生物打印組織氣管領域有極大的研究價值。dECM也是近年來運用于生物墨水領域的一大熱門材料，基于dECM的油墨通過靶組織的脫細胞化過程制造。其具有組織特異性微環境的固有成分，如蛋白聚糖和糖蛋白等。迄今為止，已經報道了各種基于dECM的油墨用于靶向特異性組織，如衍生皮膚、骨、血管、肝臟、腎臟等，每種衍生組織具有不同的可印刷性[18]。
2.1 水凝膠
水凝膠在3D生物打印中能夠為細胞提供結合位點，用于其附著、增殖和分化[19]。例如膠原蛋白現在就是一種有吸引力的生物墨水成分，其中Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）是最豐富的膠原蛋白類型，經常用作體外3D細胞培養環境。將膠原蛋白摻入生物墨水的優點包括高生物相容性，增加細胞擴散、附著、增殖和更有利于各種細胞行為[20]。然而，COLⅠ溶液通常在剪切稀化特性上表現不佳，不能夠在剪切應力消除后及時恢復原始粘度，流動性較大，這使得局限使用膠原蛋白油墨難以控制3D形狀保真度。考慮到這些問題，研究者們發現膠原蛋白的分子衍生物—甲基丙烯酸酐化明膠（gelatin methacryloyl， GelMA）。GelMA因其與膠原蛋白相比具有更強的剪切稀化性和耐熱性而受組織培養領域的青睞。例如Leucht團隊已將GelMA生物墨水用于打印血管化的骨基質結構[21]。打印出來的軟骨細胞不僅具有更大剛度和彈性模量的結構[22]，而且在生理溫度37℃下有極大的生物活性，同時使用GelMA打印3D組織可減少在骨組織形成過程中造骨細胞和血管生成細胞之間的旁分泌串擾。另外，有研究[23]證明在沒有任何外源性成骨因子的情況下，GelMA水凝膠能夠觸發成骨細胞的礦化沉積，這為直接在氣管植入物表面制造骨涂層并包裝用于手術鋪平了道路，驗證了GelMA在組織氣管領域有非常重要的應用意義。
2.2 脫細胞生物墨水
近幾年研究者們著重于一類新型組織特異性混合生物墨水的開發，旨在確保復雜的3D生物打印期間和之后細胞仍然保持生物活性[24-25]，并且具有剪切稀化性能。Martina團隊[26]研究出一種由海藻酸鹽、dECM和Ca2+快速交聯形成的生物墨水。混合生物墨水系統中ECM的存在增強了3D生物打印期間原代人類祖細胞的存活率，支持組織特異性細胞分化，并刺激體內植入物的全層血管形成，同時最大限度減少異物反應。Martina團隊為了驗證這一點，他們生成了含有小鼠或人肺上皮細胞系和用細胞跟蹤染料標記的小鼠腦內皮細胞系的生物墨水，并進行了離子交聯。通過5-乙炔基-2'-脫氧尿苷染色和流式細胞術評估，細胞代謝活性增加對應于dECM生物墨水中鼠肺上皮細胞增殖的增加，表明ECM組分具有生物活性并誘導增殖。有趣的是，當通過移液管使用手動擠出形成生物墨水時，沒有觀察到代謝活性的變化，這表明dECM生物墨水可在3D生物打印期間保護細胞。
Martina團隊[27]在已知細胞經歷增加的剪切應力的情況下，使用流體動力學來研究dECM和海藻酸鹽溶液是否具有不同的流體剪切應力曲線，發現兩個生物墨水的平均剪切應力曲線高度相似。這表明在打印后觀察到的代謝活性差異并非源于本體流體性質，而可能是由于ECM溶液中存在生物活性因子。另外，Martina團隊[28]使用振蕩流變測量法表征了dECM生物墨水的流變特性，發現與海藻酸鹽相比，在dECM生物墨水中添加ECM會導致剪切稀化行為，這有利于3D生物打印。因此該混合生物墨水是一種理想型的兼具生物相容性和剪切稀化性的材料，同時該團隊也表明含有肺dECM的生物墨水可用于3D生物打印由區域指定的原代人肺平滑肌和人氣道上皮祖細胞組成的亞節段人類支氣管，這些細胞可以分化成人類氣道中發現的多種細胞類型。dECM生物墨水被確定為一類有前途的新型生物墨水，可用于開發移植功能組織的研究。
3 剪切稀化型生物墨水的制備方法
常規的剪切稀化型生物墨水制備方法有脫細胞劑和物理法。脫細胞劑包括酸、堿、去污劑、低滲和高滲溶液以及醇類溶劑等化學制劑和核酸酶、胰蛋白酶、膠原酶、脂肪酶、熱解素和α-半乳糖苷酶等生物制劑[29]。另外物理法包括溫度、光、力、電擊等[30]。例如3D生物打印技術中有一類叫做機器人點膠，該技術沿著不同的途徑可以沉積連續的水凝膠線，從而能夠產生復雜的多細胞組織結構[31]。剪切應力在生物打印中特別重要，在任何點膠過程中都是不可避免的[32]。剪切應力水平直接受不同印刷參數的影響，例如噴嘴直徑、印刷壓力和點膠介質的粘度。此外，研究者們還發現剪切應力在細胞信號傳導和蛋白質表達中起決定性的作用，可以促進巨核細胞的成熟和干細胞的分化[33]。研究者們采用廣泛應用于3D生物打印的剪切稀化型生物墨水海藻酸鹽作為研究剪切應力的模體，他們發現短時間暴露于高水平的剪切應力不僅會在打印后立即影響細胞活力，而且還會誘導在分配過程中存活的細胞增殖潛力的長期改變。相比較之下，暴露于相對低水平剪切應力（<5 kPa）的細胞既沒有表現出短期損害，也沒有表現出長期損害。這些發現表明，低于特定的剪切應力閾值，細胞可以被打印出來而沒有副作用[34]。
近幾年來，基因工程編輯或成為剪切稀化型生物墨水的新制備法。在這之前，尚無完全利用微生物的遺傳可編程性來合理控制生物墨水機械性能的實際操作。由于在這一領域的缺失，所以有研究者著手致力于開發一種新型生物墨水，他們將其命名為“微生物墨水”。其完全由基因工程微生物細胞產生，將蛋白質單體自下而上地分層自組裝成納米纖維，并進一步進入包含可擠出水凝膠的納米纖維網絡[35]。
常規思路是將微生物嵌入ECM模擬生物墨水中，但是該實驗創新性地將微生物膜本身的ECM重新用作可編程生物墨水。在實驗過程中，研究者們成功證明大腸桿菌生物膜ECM的天然蛋白質姜黃素納米纖維可以通過將功能性肽/蛋白質融合到Curli CsgA單體上進行基因工程改造，以產生剪切稀化型生物墨水[36]。Curli菌毛是生物被膜的重要組成成分，而CsgA是Curli分泌系統的重要底物[37]，該實驗能夠將Curli分泌系統運用到基因工程中，可以在較大程度上保證生物墨水剪切稀化性的改造。由于剪切稀化的特性，這些生物墨水可以打印成能響應機械變形的復雜形狀。其壓縮模量提高 20倍，并且可以承受高達80% 的應變而不會發生永久變形，符合人體氣管的解剖學特性。
4 剪切稀化型生物墨水在3D生物打印組織氣管中的應用現狀
近年來，基于生物打印印刷過程中保護細胞免受剪切力的同時，保證印刷結構的穩定性，有許多團隊就剪切稀化型生物墨水在3D打印組織氣管領域有了許多新的研究成果。
Zandi團隊利用人工合成鋰藻土（laponite，LA）和糖胺聚糖納米顆粒來制作一種具有剪切稀化性能的納米復合水凝膠[38]。在水凝膠中摻入LA可以顯著促進所得生物材料的流變和機械性能[39]。此外，體外研究還顯示，LA可改善人骨髓基質細胞（hMSCs）的軟骨分化，并在不使用生長因子的情況下刺激hMSCs的成骨分化[40]，這是促進組織氣管軟骨分化的一大優勢。另一方面，糖胺聚糖的生理特性使這些聚合物有希望通過與硅酸鹽納米材料的雜交來制備水凝膠。天然組織中的糖胺聚糖與蛋白質共價結合，形成堿性蛋白聚糖。一旦與蛋白質結合，糖胺聚糖就會與幾個淺表細胞位點發生反應，化學修飾的糖胺聚糖也可以誘導hMSCs的成骨分化[41]。總而言之，Zandi團隊不僅證明了該水凝膠的剪切變稀可保護封裝細胞在生物打印過程中免受侵蝕性剪切應力，而且也證明了封裝在納米復合水凝膠內的前小鼠骨髓基質細胞可以體外成骨分化。具有骨誘導特性的工程剪切變稀水凝膠可用作3D打印組織氣管的新生物墨水，這也是3D生物打印組織氣管領域中的一大突破。
軟骨是一種致密、靈活且可承重的無血管組織，由少量軟骨細胞（10%～15%）組成，具有有限的自再生特性[42]。因此，用組織工程方法替換氣管軟骨環的需求很高。而納米纖維素（nanofibrillated cellulose，NFC）是一種無細胞毒性，有穩定的生物打印特性和形狀保真度的功能性聚合物。并且NFC在顯微鏡下與膠原纖維相似。其寬度約100 nm，與膠原蛋白原纖維相似[43]。基于NFC的這些特性，Markstedt等[44]開發了一種功能性生物墨水，該生物墨水結合了NFC的結構穩定性能與海藻酸鹽的剪切變稀性能。Markstedt團隊在對NFC-海藻酸鹽生物墨水用臺盼藍染色進行細胞活力檢測時，發現即使在打印過程中部分細胞活力會有損失，但是在培養7 d后細胞活力恢復到打印前的水平。由于NFC-海藻酸鹽生物墨水在軟骨細胞活力方面有出色表現，并且有因剪切稀化性能而具有的高形狀保真度和高打印分辨率，使得該生物墨水在活組織和器官的3D生物打印中具有潛在的用途，可應用于鼻軟骨、半月板等，特別是用于氣管軟骨環的生長。
觸變性生物墨水也是有利的生物墨水，因為其也表現出剪切稀化特性。傳統的剪切稀化材料會隨著剪切速率的增加而表現出較低的粘度，而觸變性材料可能會隨著施加剪切力的持續時間增加（例如通過攪拌）表現出降低的表觀粘度[17]。有研究者團隊[45]開發了一種新型混合觸變性生物墨水，該生物模式結合了剛性結冷膠（gellan gum，GG），柔性海藻酸鈉（sodium alginate，SA）和生物活性物質觸變磷酸鎂基凝膠（thixotropic magnesium phosphate-based gel，TMP-BG）。配制的雜化GG-SA/TMP-BG生物墨水由于剪切稀化性能而具有良好的印刷適性，同時也可以模擬組織氣管的各種ECM，并支持3D打印氣管結構的完整性。此外，由于觸變性生物墨水的剪切稀化特性，細胞表現出良好的細胞存活率。共聚焦顯微鏡顯示打印構建體中細胞均勻分布，存活超過7 d。 體內動物實驗表明，沒有細胞的雜交生物墨水可以誘導氣管軟骨修復。因此，這種混合觸變性生物墨水具有良好的可打印性、生物相容性、結構穩定性和生物活性，在3D生物打印組織氣管中具有廣闊的應用前景[46]。
剪切稀化型生物墨水除了能夠應用于制作組織氣管，同時也能夠應用于制作氣管塞。例如先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia，CDH）是一種出生缺陷，其特征是膈肌閉合失敗、胸腔內臟突出和肺部發育受損[46]。在大多數嚴重的情況下，通過導管安裝的球囊進行胎兒鏡下腔內氣管閉塞（fetoscopic endoluminal tracheal occlusion，FETO）以抑制肺發育不良，即可在妊娠26～28周時，通過超聲引導的胎兒鏡檢查，在氣管腔內插入導管安裝的球囊并充氣，可獲得閉塞。然而，該手術為了在胎兒生長過程中獲得有效和持久的閉塞，球囊被充氣到大于氣管腔的直徑，誘導的變形會對周圍組織造成相關損傷[47]。為了避免這樣的風險，Campiglio團隊[46]制作了一種可降解的剪切稀化型水凝膠—鈣-海藻酸鹽和透明質酸/甲基纖維素混合物（hyaluronan/methylcellulose，HA-MC）作為FETO。讓其代替球囊，以用于暫時的氣管閉塞。在多次試驗中，研究者們發現HA-MC的剪切變稀行為也可以逐漸適應氣道的擴大。同時可降解水凝膠可以自發地排出羊水，這是程序性降解的結果（插入后約4～6周）。由剪切稀化型水凝膠構成的FETO實現有效的閉塞，而不會產生球囊帶來的大而有害的變形。此外，剪切稀化型水凝膠符合氣管解剖結構，并可以適應其生長而不會誘發顯著的組織變形。
5 結論與展望
剪切稀化型生物墨水一直是3D生物打印組織工程中的研究熱點，具有剪切稀化性能的生物墨水能夠實現組織氣管打印的保真度，同時提高細胞活性。同時剪切應力對于生物墨水成型以及活性都有深遠的影響，上述研究為制造具有更好機械性能的人體氣管提供了新的可能。其中脫細胞生物墨水具有仿生性，能夠更好地模擬人體微環境；而水凝膠具有高強度和可注射性，但流動性較大不易定型。目前應用最廣的剪切稀化型生物墨水便是海藻酸鹽，研究者們以此為基礎，將其與dECM或者其他新型材料結合成特異性混合生物墨水，為提高剪切稀化性能提供了新平臺。而近年來，除了常規的物理法、化學法和生物制劑來制備生物墨水，基因工程也開始用于制備具有多功能的墨水材料以滿足更多人體需求，這將是3D打印組織氣管的一大突破。在目前的3D打印組織氣管應用現狀中，納米材料經常與HA、明膠以及海藻酸鹽類結合制作剪切稀化型生物墨水。觸變性生物墨水也是一種有利的剪切稀化型生物墨水，較上述傳統剪切稀化材料來說會隨著施加剪切力的持續時間而非速率增加而表現出降低的表觀粘度，同樣有望在3D生物打印組織氣管中具有廣闊的應用前景。
利益沖突：無。
作者貢獻：孫藝琪負責論文初稿撰寫與修改；徐翔宇負責文章的整體構思與文獻檢索；孫飛、單一波、沈志明、史宏燦負責修改后審校。
3D生物打印這些年來發展很快，已經成為器官缺損修復的研究熱點。其主要包括種子細胞、生物支架、生物因子和生物墨水等，其中生物墨水有至關重要的作用，是生物材料和生物單元用3D打印的手段制造出具有個性化的生物功能結構體，能夠滿足仿生形態學、生物體功能、細胞生長微環境等要求[1]。氣管是一種管狀結構，是下呼吸道起始段，是連接喉部和支氣管之間的管道。氣管是由上皮、基底膜、結締組織、平滑肌和軟骨層組成的復合管狀結構[2]。所以3D生物打印組織氣管中復雜功能結構的制造需要生物墨水的精確逐層放置和凝固，這一過程中，生物打印層需要保持其形狀及先前定義的3D結構，而打印過程中組織細胞會在活力和性能方面受到負面影響[3-5]，其中生物墨水的流變特性是解該決問題的重要點。生物打印中最常用的方法是通過打印頭將生物墨水擠出沉積到收集器上，同時將生物墨水快速相變為固體狀材料。這就需要生物墨水粘度足夠低，允許通過打印頭擠出，同時重新凝膠化的速度需要足夠快以保證在擠出后保持3D形狀[5]。由于這些要求，具有剪切變稀特性的生物墨水成為許多生物打印應用的焦點。當對材料施加高剪切應力時，剪切稀化型生物墨水顯示出低粘度，并且在剪切應力消除后恢復其原始粘度[6]。本文將對剪切稀化型生物墨水機械性能的重要性，該生物墨水的分類、制備方法和在3D打印組織氣管的應用現狀進行討論。
1 剪切稀化型生物墨水機械性能的重要性
理想的剪切稀化型生物墨水隨著剪切速率的增加而表現出低粘度，增加的剪切稀化行為證實了其可注射性，而不會在打印過程中堵塞噴嘴。基于這樣的特性，該生物墨水具有出色的印刷適性，形狀保真度和結構穩定性等機械性能，對生物打印性能和最終結構的剛性有很大的影響[7]。除此之外，機械應力對細胞存活和功能也有深遠的影響，所以這就要求生物墨水的機械性能能夠滿足人體細胞微環境的要求[8]。圍繞這一點，Fischer團隊在生物打印過程中精確控制了噴嘴部位的剪切應力，并研究了不同水平的剪切應力對人類間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）活力和增殖的影響[9]。結果發現，在剪切應力閾值下，載細胞可以進行生物打印而不會產生副作用。然而，高剪切應力會影響生物打印過程中MSCs的細胞活力，甚至會進一步誘導存活細胞增殖的長期改變。而剪切稀化型墨水主要是利用一些材料的表觀粘度隨剪切應力增加而減小的現象，在不受到剪切力時表現為凝膠態，當受到剪切力作用時變為溶膠態。因此，具有剪切稀化特性的生物墨水通常被使用在生物打印中，因為擠出過程中的低剪切應力有利于細胞存活和功能保留[10]。另外，Alblas團隊采用甲基丙烯酸化透明質酸（methacrylated hyaluronic acid ，MeHA）構成生物墨水對骨組織進行3D生物打印[11]。透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種天然多糖，但純HA的機械性能較差，導致結構支撐有限[12]。而進行聚合物化學改性后的MeHA顯示出更好的剪切稀化性能，便于3D生物打印，從而實現高分辨率印刷[13]。Alblas團隊發現僅基于MeHA生物墨水的機械性能誘導摻入的MSCs成骨分化，而無需額外的成骨刺激。摻入的細胞在培養21 d后顯示出約64.4%的活力，證明了MeHA的生物相容性。這也就證明剪切稀化型生物墨水在3D生物打印組織氣管領域中有良好的應用前景，因為其剪切稀化的特性不僅能夠促進氣管軟骨環的復雜精密結構的成型，同時也能夠提供相應的成骨刺激、提高印刷適性和細胞活性。
總之，所用生物墨水的機械性能對于3D結構的形成至關重要。機械性能不僅影響生物打印性能和最終結構的剛性，而且還直接影響細胞行為和活性，包括活力和分化[14]。
2 剪切稀化型生物墨水材料的分類
生物墨水材料中目前應用最廣泛、性能最突出的便是水凝膠和脫細胞細胞外基質（dECM）。水凝膠是一類具有良好親水性和3D網絡結構的軟質濕潤生物墨水材料，由于其結構和組成與天然細胞外基質（ECM）的相似性，在生物醫學工程領域引起了越來越多的關注。水凝膠具有高強度和可注射性[15-16]，通常分為天然型和合成型這兩種[17]，被認為是軟骨組織工程的承重組織和骨缺損治療的理想候選者，在3D生物打印組織氣管領域有極大的研究價值。dECM也是近年來運用于生物墨水領域的一大熱門材料，基于dECM的油墨通過靶組織的脫細胞化過程制造。其具有組織特異性微環境的固有成分，如蛋白聚糖和糖蛋白等。迄今為止，已經報道了各種基于dECM的油墨用于靶向特異性組織，如衍生皮膚、骨、血管、肝臟、腎臟等，每種衍生組織具有不同的可印刷性[18]。
2.1 水凝膠
水凝膠在3D生物打印中能夠為細胞提供結合位點，用于其附著、增殖和分化[19]。例如膠原蛋白現在就是一種有吸引力的生物墨水成分，其中Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）是最豐富的膠原蛋白類型，經常用作體外3D細胞培養環境。將膠原蛋白摻入生物墨水的優點包括高生物相容性，增加細胞擴散、附著、增殖和更有利于各種細胞行為[20]。然而，COLⅠ溶液通常在剪切稀化特性上表現不佳，不能夠在剪切應力消除后及時恢復原始粘度，流動性較大，這使得局限使用膠原蛋白油墨難以控制3D形狀保真度。考慮到這些問題，研究者們發現膠原蛋白的分子衍生物—甲基丙烯酸酐化明膠（gelatin methacryloyl， GelMA）。GelMA因其與膠原蛋白相比具有更強的剪切稀化性和耐熱性而受組織培養領域的青睞。例如Leucht團隊已將GelMA生物墨水用于打印血管化的骨基質結構[21]。打印出來的軟骨細胞不僅具有更大剛度和彈性模量的結構[22]，而且在生理溫度37℃下有極大的生物活性，同時使用GelMA打印3D組織可減少在骨組織形成過程中造骨細胞和血管生成細胞之間的旁分泌串擾。另外，有研究[23]證明在沒有任何外源性成骨因子的情況下，GelMA水凝膠能夠觸發成骨細胞的礦化沉積，這為直接在氣管植入物表面制造骨涂層并包裝用于手術鋪平了道路，驗證了GelMA在組織氣管領域有非常重要的應用意義。
2.2 脫細胞生物墨水
近幾年研究者們著重于一類新型組織特異性混合生物墨水的開發，旨在確保復雜的3D生物打印期間和之后細胞仍然保持生物活性[24-25]，并且具有剪切稀化性能。Martina團隊[26]研究出一種由海藻酸鹽、dECM和Ca2+快速交聯形成的生物墨水。混合生物墨水系統中ECM的存在增強了3D生物打印期間原代人類祖細胞的存活率，支持組織特異性細胞分化，并刺激體內植入物的全層血管形成，同時最大限度減少異物反應。Martina團隊為了驗證這一點，他們生成了含有小鼠或人肺上皮細胞系和用細胞跟蹤染料標記的小鼠腦內皮細胞系的生物墨水，并進行了離子交聯。通過5-乙炔基-2'-脫氧尿苷染色和流式細胞術評估，細胞代謝活性增加對應于dECM生物墨水中鼠肺上皮細胞增殖的增加，表明ECM組分具有生物活性并誘導增殖。有趣的是，當通過移液管使用手動擠出形成生物墨水時，沒有觀察到代謝活性的變化，這表明dECM生物墨水可在3D生物打印期間保護細胞。
Martina團隊[27]在已知細胞經歷增加的剪切應力的情況下，使用流體動力學來研究dECM和海藻酸鹽溶液是否具有不同的流體剪切應力曲線，發現兩個生物墨水的平均剪切應力曲線高度相似。這表明在打印后觀察到的代謝活性差異并非源于本體流體性質，而可能是由于ECM溶液中存在生物活性因子。另外，Martina團隊[28]使用振蕩流變測量法表征了dECM生物墨水的流變特性，發現與海藻酸鹽相比，在dECM生物墨水中添加ECM會導致剪切稀化行為，這有利于3D生物打印。因此該混合生物墨水是一種理想型的兼具生物相容性和剪切稀化性的材料，同時該團隊也表明含有肺dECM的生物墨水可用于3D生物打印由區域指定的原代人肺平滑肌和人氣道上皮祖細胞組成的亞節段人類支氣管，這些細胞可以分化成人類氣道中發現的多種細胞類型。dECM生物墨水被確定為一類有前途的新型生物墨水，可用于開發移植功能組織的研究。
3 剪切稀化型生物墨水的制備方法
常規的剪切稀化型生物墨水制備方法有脫細胞劑和物理法。脫細胞劑包括酸、堿、去污劑、低滲和高滲溶液以及醇類溶劑等化學制劑和核酸酶、胰蛋白酶、膠原酶、脂肪酶、熱解素和α-半乳糖苷酶等生物制劑[29]。另外物理法包括溫度、光、力、電擊等[30]。例如3D生物打印技術中有一類叫做機器人點膠，該技術沿著不同的途徑可以沉積連續的水凝膠線，從而能夠產生復雜的多細胞組織結構[31]。剪切應力在生物打印中特別重要，在任何點膠過程中都是不可避免的[32]。剪切應力水平直接受不同印刷參數的影響，例如噴嘴直徑、印刷壓力和點膠介質的粘度。此外，研究者們還發現剪切應力在細胞信號傳導和蛋白質表達中起決定性的作用，可以促進巨核細胞的成熟和干細胞的分化[33]。研究者們采用廣泛應用于3D生物打印的剪切稀化型生物墨水海藻酸鹽作為研究剪切應力的模體，他們發現短時間暴露于高水平的剪切應力不僅會在打印后立即影響細胞活力，而且還會誘導在分配過程中存活的細胞增殖潛力的長期改變。相比較之下，暴露于相對低水平剪切應力（<5 kPa）的細胞既沒有表現出短期損害，也沒有表現出長期損害。這些發現表明，低于特定的剪切應力閾值，細胞可以被打印出來而沒有副作用[34]。
近幾年來，基因工程編輯或成為剪切稀化型生物墨水的新制備法。在這之前，尚無完全利用微生物的遺傳可編程性來合理控制生物墨水機械性能的實際操作。由于在這一領域的缺失，所以有研究者著手致力于開發一種新型生物墨水，他們將其命名為“微生物墨水”。其完全由基因工程微生物細胞產生，將蛋白質單體自下而上地分層自組裝成納米纖維，并進一步進入包含可擠出水凝膠的納米纖維網絡[35]。
常規思路是將微生物嵌入ECM模擬生物墨水中，但是該實驗創新性地將微生物膜本身的ECM重新用作可編程生物墨水。在實驗過程中，研究者們成功證明大腸桿菌生物膜ECM的天然蛋白質姜黃素納米纖維可以通過將功能性肽/蛋白質融合到Curli CsgA單體上進行基因工程改造，以產生剪切稀化型生物墨水[36]。Curli菌毛是生物被膜的重要組成成分，而CsgA是Curli分泌系統的重要底物[37]，該實驗能夠將Curli分泌系統運用到基因工程中，可以在較大程度上保證生物墨水剪切稀化性的改造。由于剪切稀化的特性，這些生物墨水可以打印成能響應機械變形的復雜形狀。其壓縮模量提高 20倍，并且可以承受高達80% 的應變而不會發生永久變形，符合人體氣管的解剖學特性。
4 剪切稀化型生物墨水在3D生物打印組織氣管中的應用現狀
近年來，基于生物打印印刷過程中保護細胞免受剪切力的同時，保證印刷結構的穩定性，有許多團隊就剪切稀化型生物墨水在3D打印組織氣管領域有了許多新的研究成果。
Zandi團隊利用人工合成鋰藻土（laponite，LA）和糖胺聚糖納米顆粒來制作一種具有剪切稀化性能的納米復合水凝膠[38]。在水凝膠中摻入LA可以顯著促進所得生物材料的流變和機械性能[39]。此外，體外研究還顯示，LA可改善人骨髓基質細胞（hMSCs）的軟骨分化，并在不使用生長因子的情況下刺激hMSCs的成骨分化[40]，這是促進組織氣管軟骨分化的一大優勢。另一方面，糖胺聚糖的生理特性使這些聚合物有希望通過與硅酸鹽納米材料的雜交來制備水凝膠。天然組織中的糖胺聚糖與蛋白質共價結合，形成堿性蛋白聚糖。一旦與蛋白質結合，糖胺聚糖就會與幾個淺表細胞位點發生反應，化學修飾的糖胺聚糖也可以誘導hMSCs的成骨分化[41]。總而言之，Zandi團隊不僅證明了該水凝膠的剪切變稀可保護封裝細胞在生物打印過程中免受侵蝕性剪切應力，而且也證明了封裝在納米復合水凝膠內的前小鼠骨髓基質細胞可以體外成骨分化。具有骨誘導特性的工程剪切變稀水凝膠可用作3D打印組織氣管的新生物墨水，這也是3D生物打印組織氣管領域中的一大突破。
軟骨是一種致密、靈活且可承重的無血管組織，由少量軟骨細胞（10%～15%）組成，具有有限的自再生特性[42]。因此，用組織工程方法替換氣管軟骨環的需求很高。而納米纖維素（nanofibrillated cellulose，NFC）是一種無細胞毒性，有穩定的生物打印特性和形狀保真度的功能性聚合物。并且NFC在顯微鏡下與膠原纖維相似。其寬度約100 nm，與膠原蛋白原纖維相似[43]。基于NFC的這些特性，Markstedt等[44]開發了一種功能性生物墨水，該生物墨水結合了NFC的結構穩定性能與海藻酸鹽的剪切變稀性能。Markstedt團隊在對NFC-海藻酸鹽生物墨水用臺盼藍染色進行細胞活力檢測時，發現即使在打印過程中部分細胞活力會有損失，但是在培養7 d后細胞活力恢復到打印前的水平。由于NFC-海藻酸鹽生物墨水在軟骨細胞活力方面有出色表現，并且有因剪切稀化性能而具有的高形狀保真度和高打印分辨率，使得該生物墨水在活組織和器官的3D生物打印中具有潛在的用途，可應用于鼻軟骨、半月板等，特別是用于氣管軟骨環的生長。
觸變性生物墨水也是有利的生物墨水，因為其也表現出剪切稀化特性。傳統的剪切稀化材料會隨著剪切速率的增加而表現出較低的粘度，而觸變性材料可能會隨著施加剪切力的持續時間增加（例如通過攪拌）表現出降低的表觀粘度[17]。有研究者團隊[45]開發了一種新型混合觸變性生物墨水，該生物模式結合了剛性結冷膠（gellan gum，GG），柔性海藻酸鈉（sodium alginate，SA）和生物活性物質觸變磷酸鎂基凝膠（thixotropic magnesium phosphate-based gel，TMP-BG）。配制的雜化GG-SA/TMP-BG生物墨水由于剪切稀化性能而具有良好的印刷適性，同時也可以模擬組織氣管的各種ECM，并支持3D打印氣管結構的完整性。此外，由于觸變性生物墨水的剪切稀化特性，細胞表現出良好的細胞存活率。共聚焦顯微鏡顯示打印構建體中細胞均勻分布，存活超過7 d。 體內動物實驗表明，沒有細胞的雜交生物墨水可以誘導氣管軟骨修復。因此，這種混合觸變性生物墨水具有良好的可打印性、生物相容性、結構穩定性和生物活性，在3D生物打印組織氣管中具有廣闊的應用前景[46]。
剪切稀化型生物墨水除了能夠應用于制作組織氣管，同時也能夠應用于制作氣管塞。例如先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia，CDH）是一種出生缺陷，其特征是膈肌閉合失敗、胸腔內臟突出和肺部發育受損[46]。在大多數嚴重的情況下，通過導管安裝的球囊進行胎兒鏡下腔內氣管閉塞（fetoscopic endoluminal tracheal occlusion，FETO）以抑制肺發育不良，即可在妊娠26～28周時，通過超聲引導的胎兒鏡檢查，在氣管腔內插入導管安裝的球囊并充氣，可獲得閉塞。然而，該手術為了在胎兒生長過程中獲得有效和持久的閉塞，球囊被充氣到大于氣管腔的直徑，誘導的變形會對周圍組織造成相關損傷[47]。為了避免這樣的風險，Campiglio團隊[46]制作了一種可降解的剪切稀化型水凝膠—鈣-海藻酸鹽和透明質酸/甲基纖維素混合物（hyaluronan/methylcellulose，HA-MC）作為FETO。讓其代替球囊，以用于暫時的氣管閉塞。在多次試驗中，研究者們發現HA-MC的剪切變稀行為也可以逐漸適應氣道的擴大。同時可降解水凝膠可以自發地排出羊水，這是程序性降解的結果（插入后約4～6周）。由剪切稀化型水凝膠構成的FETO實現有效的閉塞，而不會產生球囊帶來的大而有害的變形。此外，剪切稀化型水凝膠符合氣管解剖結構，并可以適應其生長而不會誘發顯著的組織變形。
5 結論與展望
剪切稀化型生物墨水一直是3D生物打印組織工程中的研究熱點，具有剪切稀化性能的生物墨水能夠實現組織氣管打印的保真度，同時提高細胞活性。同時剪切應力對于生物墨水成型以及活性都有深遠的影響，上述研究為制造具有更好機械性能的人體氣管提供了新的可能。其中脫細胞生物墨水具有仿生性，能夠更好地模擬人體微環境；而水凝膠具有高強度和可注射性，但流動性較大不易定型。目前應用最廣的剪切稀化型生物墨水便是海藻酸鹽，研究者們以此為基礎，將其與dECM或者其他新型材料結合成特異性混合生物墨水，為提高剪切稀化性能提供了新平臺。而近年來，除了常規的物理法、化學法和生物制劑來制備生物墨水，基因工程也開始用于制備具有多功能的墨水材料以滿足更多人體需求，這將是3D打印組織氣管的一大突破。在目前的3D打印組織氣管應用現狀中，納米材料經常與HA、明膠以及海藻酸鹽類結合制作剪切稀化型生物墨水。觸變性生物墨水也是一種有利的剪切稀化型生物墨水，較上述傳統剪切稀化材料來說會隨著施加剪切力的持續時間而非速率增加而表現出降低的表觀粘度，同樣有望在3D生物打印組織氣管中具有廣闊的應用前景。
利益沖突：無。
作者貢獻：孫藝琪負責論文初稿撰寫與修改；徐翔宇負責文章的整體構思與文獻檢索；孫飛、單一波、沈志明、史宏燦負責修改后審校。