銅死亡是最近被定義的一種不同于程序性細胞死亡的獨特死亡方式，是由線粒體內銅過載觸發的細胞死亡過程。銅死亡相關基因與腫瘤的發生發展存在一定相關性，這使得靶向銅死亡途徑的抗腫瘤治療成為潛在方向，銅離子載體藥物可以將銅離子轉入細胞從而誘導細胞銅死亡，為銅死亡在腫瘤治療中的應用奠定基礎。此外，本文對銅穩態及銅死亡相關機制進行闡述，進一步闡明銅死亡作為肺癌治療靶點的可能。本綜述旨在總結目前銅死亡及肺癌相關研究進展，為肺癌的臨床治療提供新的理論和依據。
肺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤，死亡率為惡性腫瘤的首位[1]。其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）為主要的病理亞型，約占 85%。手術切除、化療和放療是肺癌傳統的治療方式，但是由于化療和放療的非特異性，在抗腫瘤的同時會引起骨髓抑制、胃腸道反應等副作用。隨著對精準治療的不斷探索，針對突變靶點的靶向治療也是NSCLC的一種重要的治療手段[2]。而當缺乏敏感突變時，免疫治療則成了NSCLC治療的另一種重要手段，且相比于傳統的放化療在療效和耐受性等方面都有提升[3-4]。近年來，一些可能誘導癌細胞精確死亡的細胞死亡方式開始受到廣泛關注，有望為NSCLC的精準治療提供新的靶點。
銅（copper，Cu），作為一種人體必需的微量元素，與多種信號傳導途徑及與腫瘤相關的生物學行為有著密切的聯系[5]。Tsvetkov等[6]于2022年定義了一種銅依賴的新型細胞死亡方式，即銅死亡。這種死亡方式由線粒體內銅過載誘導，進而使得三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環相關的脂酰化二氫硫辛酸轉乙酰基酶（dihydrolipoyl transacetylase，DLAT）積聚，該產物的堆積最終引發蛋白質毒性應激，從而導致細胞死亡[7]。鑒于銅死亡與細胞代謝的緊密關聯，大量銅死亡相關研究聚焦于具有特定代謝狀態的癌種，主要包括一些具有較高有氧呼吸水平及高線粒體代謝活性的腫瘤，如黑色素瘤、乳腺癌等[8-10]，以及具有腫瘤干性的惡性腫瘤[11-12]。此外，在Tsvetkov等[6]的研究中，通過全基因組CRISPR敲除篩選，成功鑒定出包括CDKN2A、FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1、PDHB在內的10個與銅死亡過程密切相關的基因，加上銅離子轉運相關的ATP7A、ATP7B和SLC31A1，這13個基因被稱為銅死亡關鍵基因（cuproptosis key genes，CKGs），于是大量生物信息學研究通過分析CKGs的表達水平，構建了基于CKGs的基因簽名及風險評分，以闡明CKGs以及CKGs相關基因與腫瘤治療療效及預后的相關性[13-18]，但其中僅有少數基因通過體內外得到驗證[19]。而作為誘導細胞內銅過載，進而導致銅死亡的關鍵工具—銅離子載體藥物，其發現使得體內外研究銅死亡成為可能，推動了銅死亡相關機制研究和探索[20-21]。因此，本文旨在對銅穩態及銅死亡機制進行闡述，并試圖闡明銅死亡與肺癌治療靶點之間的關系，總結目前銅死亡及肺癌相關研究進展，為肺癌的臨床治療提供新理論和依據。
1 銅穩態到銅死亡
人體主要通過飲食攝入銅，食物中的銅通過銅轉運蛋白在小腸上皮細胞表面吸收，并通過銅離子ATP酶轉運酶α肽排至血液中[22] 。血液中的銅離子主要以蛋白質結合形式存在，而非游離狀態，約75%的銅離子與銅藍蛋白以不可交換的形式結合。銅離子隨后通過門靜脈系統被運輸至肝臟[23] ，肝臟不僅是銅儲存的主要場所，也是銅離子體內排泄的關鍵器官，肝細胞中過量銅通過ATP轉運酶β肽排泄到膽汁中，接著隨尿液排出人體[24]，從而構成一套完整的體內銅穩態系統。
銅在細胞功能中具有雙重作用。一方面，穩態下的銅通過提供或接收電子發揮酶的伴侶作用[5] ；另一方面，銅的異常過載可能導致一系列細胞代謝功能障礙，最終誘導細胞死亡[25] 。當存在腫瘤負荷的情況下，體內銅穩態較易被打破。已在多個癌種中發現腫瘤患者的血清銅離子水平顯著高于正常個體[26-28]，其中就包括肺癌[29-30]，且肺癌患者中血清銅離子濃度的升高與臨床階段的惡化及不良預后緊密相關[30]。與小腸上皮細胞相似，腫瘤細胞對銅離子的吸收也依賴于銅轉運蛋白，其表達的變化也將直接影響細胞內銅水平[31]。銅離子在細胞內穩態的維持依賴于這些蛋白質的相互作用，銅離子穩態的失衡可能導致細胞代謝功能障礙，甚至細胞死亡。盡管血清銅水平并非等同于細胞內銅水平，但宏觀水平的銅離子水平異常也能一定程度上表征病理情況下微觀層面的銅代謝紊亂。
Tsvetkov等[6]的研究正是為這種銅離子穩態失衡誘導的細胞死亡機制提供了里程碑式的發現。他們的研究揭示了細胞內過量的銅通過促進DLAT在TCA循環中異常寡聚化來誘導銅死亡。在這個過程中，鐵氧化還原蛋白1 (ferredoxin 1，FDX1)是銅死亡的關鍵調控因素，FDX1通過將 Cu2+還原為 Cu+，促使DLAT脂酰化，脂酰化DLAT進一步發生寡聚化造成蛋白應激誘導細胞死亡 [6]。但目前銅死亡機制仍有許多未解答的問題。首先，銅死亡的特征性表現尚未被描述，包括其細胞形態變化以及分子或細胞水平上的特征性變化[6]。其次，銅離子載體藥物，如抗腫瘤藥物伊利司莫（elesclomol，ELS）和治療酒精依賴藥物雙硫侖（disulfiram，DSF）[32-34]，均存在非DLAT寡聚化誘導的蛋白質毒性應激，例如ELS可通過FDX1降低鐵硫簇蛋白穩定性[10]，DSF則通過與核定位蛋白相互作用影響泛素化蛋白質降解途徑[35-36]。可見，銅死亡相關機制有待進一步完善，仍需要更多體內外研究明確上游調控途徑及下游通路。
2 CKGs與NSCLC相關性
在Tsvetkov等[6]的研究中，通過全基因組CRISPR敲除，成功鑒定出與銅死亡密切相關的10個基因，加上銅離子轉運相關基因（SLC31A1、ATP7A及ATP7B），構成了包含13個基因的CKGs。這些基因及對應轉錄翻譯蛋白在銅死亡過程中扮演了至關重要的角色。例如，FDX1通過將Cu從二價銅還原為一價銅，展現出顯著的細胞毒性和功能性增強[10]。同樣，CDKN2A、GLS和MTF1也被證實在細胞對銅死亡的敏感性中起著決定性作用[6]。進一步研究表明，SLC31A1、ATP7A和ATP7B等基因通過調節細胞內銅離子濃度，對銅死亡過程產生影響[6] 。其中，SLC31A1基因編碼的銅離子轉運蛋白1負責銅離子的細胞內轉運，而ATP7A編碼的ATP酶轉運酶α肽和ATP7B編碼的ATP轉運酶β肽則參與銅離子的細胞外排出，共同構成了細胞銅離子轉運的重要機制，直接影響著銅的細胞內外平衡[37-39] 。
隨著對CKGs在腫瘤學領域內的深入探索，越來越多的研究[40-44]開始聚焦于這些基因在不同類型腫瘤中的表達及其潛在預后價值。針對NSCLC，研究者基于CKGs以及相關lncRNA進行生物信息學分析，成功構建預后特征并顯示出良好的預測效果[17-18]。此外，腫瘤免疫微環境（TIME）與CKGs之間的關聯已引起廣泛關注。早期研究已經揭示，TIME與一系列調節細胞死亡過程，包括凋亡、鐵死亡、焦亡、壞死及自噬等，之間存在密切聯系[45-47]。在腫瘤環境中誘導這些炎癥性細胞死亡形式可能觸發損傷相關分子模式（DAMPs）和特定細胞因子的釋放，進而調節參與抗腫瘤免疫反應的先天性及適應性免疫細胞的功能。此外，基于鐵死亡[48]、焦亡[49-50]以及壞死[51]的分子亞型已被開發，在預測與患者預后及免疫治療療效上展現出一定的價值，因此基于CKGs的腫瘤分型也引起了廣泛的關注。在NSCLC中，不少研究對CKGs與TIME以及免疫治療之間的相關性進行研究，在基于CKGs相關基因集構建的風險評分中，高風險組患者表現出免疫抑制的TIME以及較差的免疫治療響應[15-16]。研究銅死亡相關基因簽名有助于從新的視角進行肺癌患者分型，對理解肺癌生物學至關重要，目前由于銅死亡機制尚未完全闡明，尚未能在體內外實驗中驗證已發表分子分型的有效性，同時還面臨數據質量、分析可重復性等挑戰，但有賴于大樣本數據的挖掘以及統計分析方法的迭代，可以部分克服上述困難，推動銅死亡及肺癌研究進展。
3 銅死亡與NSCLC常見靶點
Tsvetkov等[6]的研究揭示了銅死亡發生的機制，但是關于銅死亡的調控及靶點并未作進一步探索。在銅死亡過程中，過量銅離子直接與有氧呼吸TCA循環中的硫辛酰化蛋白結合，導致這些蛋白發生凝集、鐵硫簇蛋白降解，以及隨后的蛋白毒性應激和細胞死亡。因此，肺癌發生發展過程中的常見突變及靶點是否可以直接調控CKGs，或者是否能夠改變腫瘤細胞能量代謝途徑（有氧呼吸/糖酵解）從而調節腫瘤細胞對線粒體呼吸依賴的銅死亡的敏感性，這種銅死亡與NSCLC治療靶點間的串擾有望為肺癌治療提供新思路、新方法。
3.1 p53
50%的肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）會發生腫瘤抑制基因 TP53 的突變。p53可通過調節下游的靶基因 ，在肺癌的發生、發展、轉移中發揮作用。野生型TP53為抑癌基因，對肺癌細胞的生長起負性調節作用。突變型TP53則具有致癌活性，是肺部腫瘤形成的原因之一[52]。大量研究表明突變型p53通過多種機制增強糖酵解、抑制氧化磷酸化以及調節脂質代謝[53-54]。因此，突變型p53可能通過這些方式增強癌細胞對銅死亡抵抗，通過靶向p53的方式調控代謝重編程從而增強銅死亡敏感性有望成為肺癌治療的有效靶點。
3.2 KRAS
KRAS突變存在于高達35%的LUAD中，且大部分與吸煙相關。KRAS的激活點突變最常見于密碼子12（G12C、G12D、G12V和G12A），而密碼子13、10或61的激活點突變較少見[55]。谷氨酰胺轉化為TCA循環的中間體α-酮戊二酸以及線粒體產生的ROS對KRAS誘導的肺癌發生發展至關重要[56]，表明線粒體代謝在KRAS誘導的肺癌進展中發揮關鍵作用。同時，研究表明靶向抑制GLS（CKGs之一，編碼谷氨酰胺酶）可以協同增強塞魯美替尼對KRAS突變型NSCLC的抗腫瘤活性，這表明KRAS突變型NSCLC與谷氨酰胺代謝密切相關[57]，提示抑制銅死亡相關基因GLS可能是KRAS突變NSCLC的新靶點。另外一項結直腸癌中研究[58]表明，ATP7A在KRAS突變的結直腸癌細胞表面表達上調，進而調節KRAS突變細胞中的細胞內銅水平并促進腫瘤生長。在肺癌中，KRAS突變與銅離子轉運途徑的關系尚不明確，有待進一步探索。
3.3 表皮生長因子受體
表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是肺癌的致癌驅動因子，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）為EGFR突變陽性患者提供了有利的治療結果[59]。研究發現，接受TKIs治療的患者氧化磷酸化水平升高[60]，提示TKIs可能增加對銅死亡的敏感性。近期一項研究[61]進一步揭示了接受奧希替尼治療的NSCLC中NCOA4上調。NCOA4是鐵自噬中的關鍵蛋白，維持了線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關鐵硫簇蛋白的合成，這些蛋白合成和活性上調增強了腫瘤細胞對銅死亡的敏感性。此外，奧希替尼與ELS復合物治療顯著提高了奧希替尼的療效且沒有額外的毒性[61]。總之，針對EGFR TKIs耐藥的NSCLC患者，聯合誘導銅死亡治療是一種潛在的新療法。
3.4 PD-L1
程序性細胞死亡蛋白1/程序性細胞死亡受體1（PD-L1/PD-1）軸是肺癌免疫治療的主要治療靶點，針對PD-L1/PD-1免疫治療已顯示出良好的臨床效果，隨著全球首個肺癌新輔助免疫治療Ⅲ期臨床研究——checkmate816的結果問世，2023年第一版NCCN指南也將納武利尤單抗聯合含鉑雙藥化療方案正式納入指南[62]。然而，由于肺癌細胞的免疫逃逸環節眾多以及治療相關的副作用，免疫治療也存在一定局限性。Voli等[63]發現，銅離子螯合劑能夠抑制STAT3和EGFR的磷酸化，從而促進PD-L1泛素化降解，最終提高免疫治療的效果。也有研究報道銅死亡納米復合物可以重塑TIME，從而增強免疫治療療效，但是具體機制尚不明確，仍有待進一步研究[64]。
4 銅離子載體藥物在NSCLC治療中的應用
ELS和DSF是兩種臨床可及的銅離子載體藥物，具有抗癌活性。DSF能提高常規化療藥物的有效性，與多西他賽、阿霉素等聯合使用時具有協同作用。一項Ⅱ期隨機對照雙盲臨床研究評估了DSF聯合順鉑-長春瑞濱化療方案的安全性及有效性[65]。該研究納入了40例晚期NSCLC患者，DSF組相比對照組展現出顯著的總生存獲益（10.0個月 vs. 7.1個月，P=0.041），其中僅有的兩例長期存活患者均出現在DSF組，而這種生存獲益并沒有在其他一些癌種中得以體現[66]。盡管樣本量有限，但作為僅有的一項DSF用于NSCLC治療的臨床研究，其結果仍然顯示出DSF用于NSCLC治療的可能性。此外，DSF與Cu的復合物（DSF-Cu）進一步拓寬了銅離子載體藥物的應用。在乳腺癌小鼠模型中，DSF-Cu處理組中上調了PD-L1的表達，進而增強了腫瘤細胞對抗PD-1免疫治療的敏感性[67]。近期一項研究表明，當與放療結合時，DSF-Cu能誘導癌細胞中的免疫原性細胞死亡，增強效應T細胞的增殖和活化，從而抑制乳腺癌轉移[68]。還有許多正在開展的臨床研究探索DSF-Cu的不同治療方式。一項Ⅰ～Ⅱ期臨床研究正在評估圍術期使用DSF-Cu治療膠質母細胞瘤的療效（NCT02715609），其采用術前單用DSF-Cu新輔助治療以及術后DSF-Cu聯合放化療輔助治療方案，研究預計于2024年9月完成。另一項Ⅱ～Ⅲ期隨機對照臨床研究中并未提示DSF-Cu治療復發性膠質母細胞瘤患者的臨床獲益（NCT02678975），研究納入88例患者并進行1∶1隨機化，結果顯示額外的DSF-Cu治療并未取得顯著的生存獲益，卻同時增加了藥物毒性[69]。綜上，DSF的臨床前研究提供了DSF協同已有腫瘤治療方式的理論基礎，且相比于膠質母細胞瘤，DSF治療已經在NSCLC患者中觀察到一定程度的生存獲益，未來有望通過進一步臨床研究探索DSF/DSF-Cu在NSCLC患者治療中的應用。
ELS是另一種銅離子載體藥物，在誘導銅死亡的專一性方面優于DSF，但其由于特殊的藥代動力學，其體內效應較DSF更弱[6]。一項已完成的臨床研究評估Ⅲb期/Ⅳ期NSCLC患者采用ELS聯合卡鉑加紫杉醇化療方案的安全性及有效性（NCT00088088），但結果并未報道。此外，還有多項早期試驗正在進行或已完成但尚未報告結果，臨床試驗結果的報告可能因各種因素而延遲。近年來，越來越多基于納米材料的ELS-Cu復合物在臨床前動物模型中驗證了有效性[64, 70-71]，在精準殺傷腫瘤細胞的同時促進了TIME的重塑，從而增強免疫治療療效。
由此可見，銅離子載體藥物在改善腫瘤治療方面具有巨大潛力，未來需進一步研究其在NSCLC治療中應用以及相關藥物的開發，使得精準誘導肺癌細胞銅死亡并協同增強已有治療方案成為可能。
5 未來及展望
盡管有許多臨床前及臨床研究初步探索了銅離子載體藥物的療效，銅死亡機制的完善仍是其在肺癌治療應用中的基石。基于目前金屬生物化學及腫瘤代謝檢測領域的豐富經驗，已有技術能夠為腫瘤中銅死亡的直接或間接檢測提供參考。銅穩態在腫瘤中的直接或間接觀測，對于識別銅依賴性細胞死亡—即銅死亡—發揮著至關重要的作用。例如，Tsvetkov等[6]利用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）量化細胞中銅濃度，在其關于銅死亡的研究中展示了離子載體如何將銅運輸進入細胞。另外，監測分子生化水平的產物可以識別銅死亡的發生。銅死亡的一個特征是Cu+與TCA循環中涉及的脂酰化線粒體酶（如DLAT）結合，誘發這些蛋白的聚集。因此，監測脂酰化蛋白的寡聚化可以判斷是否發生銅死亡。在探索銅死亡機制過程中，Tsvetkov等[6]采用免疫印跡來監測脂酰化DLAT的寡聚化，并使用共聚焦免疫熒光成像直接觀察其寡聚體的形成以及與線粒體膜的共定位情況。而通過免疫印跡或免疫組化/免疫熒光檢測銅死亡上游調節分子（如LIAS、FDX1和鐵硫簇蛋白）的表達水平變化，則間接證明了銅死亡的發生。然而，目前缺乏可靠的形態學變化作為銅死亡的指標，需要進一步的研究來提供更有效的分子標志物。
與其他癌癥相比，肺癌細胞線粒體代謝水平更高，耐藥性更強，這可能有利于今后誘導銅死亡治療，取得更好的療效。銅離子載體與肺癌常用化療藥物或免疫治療的結合也是未來可能的應用方向。綜上所述，銅死亡在肺癌治療中具有光明的前景，然而銅死亡發生的機制以及銅死亡與肺癌的聯系仍需進一步研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：董懂負責文章撰寫和語言修改；張亞杰負責問文章語言修改及內容調整；李鶴成負責文章質量監督和總體設計。
肺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤，死亡率為惡性腫瘤的首位[1]。其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）為主要的病理亞型，約占 85%。手術切除、化療和放療是肺癌傳統的治療方式，但是由于化療和放療的非特異性，在抗腫瘤的同時會引起骨髓抑制、胃腸道反應等副作用。隨著對精準治療的不斷探索，針對突變靶點的靶向治療也是NSCLC的一種重要的治療手段[2]。而當缺乏敏感突變時，免疫治療則成了NSCLC治療的另一種重要手段，且相比于傳統的放化療在療效和耐受性等方面都有提升[3-4]。近年來，一些可能誘導癌細胞精確死亡的細胞死亡方式開始受到廣泛關注，有望為NSCLC的精準治療提供新的靶點。
銅（copper，Cu），作為一種人體必需的微量元素，與多種信號傳導途徑及與腫瘤相關的生物學行為有著密切的聯系[5]。Tsvetkov等[6]于2022年定義了一種銅依賴的新型細胞死亡方式，即銅死亡。這種死亡方式由線粒體內銅過載誘導，進而使得三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環相關的脂酰化二氫硫辛酸轉乙酰基酶（dihydrolipoyl transacetylase，DLAT）積聚，該產物的堆積最終引發蛋白質毒性應激，從而導致細胞死亡[7]。鑒于銅死亡與細胞代謝的緊密關聯，大量銅死亡相關研究聚焦于具有特定代謝狀態的癌種，主要包括一些具有較高有氧呼吸水平及高線粒體代謝活性的腫瘤，如黑色素瘤、乳腺癌等[8-10]，以及具有腫瘤干性的惡性腫瘤[11-12]。此外，在Tsvetkov等[6]的研究中，通過全基因組CRISPR敲除篩選，成功鑒定出包括CDKN2A、FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1、PDHB在內的10個與銅死亡過程密切相關的基因，加上銅離子轉運相關的ATP7A、ATP7B和SLC31A1，這13個基因被稱為銅死亡關鍵基因（cuproptosis key genes，CKGs），于是大量生物信息學研究通過分析CKGs的表達水平，構建了基于CKGs的基因簽名及風險評分，以闡明CKGs以及CKGs相關基因與腫瘤治療療效及預后的相關性[13-18]，但其中僅有少數基因通過體內外得到驗證[19]。而作為誘導細胞內銅過載，進而導致銅死亡的關鍵工具—銅離子載體藥物，其發現使得體內外研究銅死亡成為可能，推動了銅死亡相關機制研究和探索[20-21]。因此，本文旨在對銅穩態及銅死亡機制進行闡述，并試圖闡明銅死亡與肺癌治療靶點之間的關系，總結目前銅死亡及肺癌相關研究進展，為肺癌的臨床治療提供新理論和依據。
1 銅穩態到銅死亡
人體主要通過飲食攝入銅，食物中的銅通過銅轉運蛋白在小腸上皮細胞表面吸收，并通過銅離子ATP酶轉運酶α肽排至血液中[22] 。血液中的銅離子主要以蛋白質結合形式存在，而非游離狀態，約75%的銅離子與銅藍蛋白以不可交換的形式結合。銅離子隨后通過門靜脈系統被運輸至肝臟[23] ，肝臟不僅是銅儲存的主要場所，也是銅離子體內排泄的關鍵器官，肝細胞中過量銅通過ATP轉運酶β肽排泄到膽汁中，接著隨尿液排出人體[24]，從而構成一套完整的體內銅穩態系統。
銅在細胞功能中具有雙重作用。一方面，穩態下的銅通過提供或接收電子發揮酶的伴侶作用[5] ；另一方面，銅的異常過載可能導致一系列細胞代謝功能障礙，最終誘導細胞死亡[25] 。當存在腫瘤負荷的情況下，體內銅穩態較易被打破。已在多個癌種中發現腫瘤患者的血清銅離子水平顯著高于正常個體[26-28]，其中就包括肺癌[29-30]，且肺癌患者中血清銅離子濃度的升高與臨床階段的惡化及不良預后緊密相關[30]。與小腸上皮細胞相似，腫瘤細胞對銅離子的吸收也依賴于銅轉運蛋白，其表達的變化也將直接影響細胞內銅水平[31]。銅離子在細胞內穩態的維持依賴于這些蛋白質的相互作用，銅離子穩態的失衡可能導致細胞代謝功能障礙，甚至細胞死亡。盡管血清銅水平并非等同于細胞內銅水平，但宏觀水平的銅離子水平異常也能一定程度上表征病理情況下微觀層面的銅代謝紊亂。
Tsvetkov等[6]的研究正是為這種銅離子穩態失衡誘導的細胞死亡機制提供了里程碑式的發現。他們的研究揭示了細胞內過量的銅通過促進DLAT在TCA循環中異常寡聚化來誘導銅死亡。在這個過程中，鐵氧化還原蛋白1 (ferredoxin 1，FDX1)是銅死亡的關鍵調控因素，FDX1通過將 Cu2+還原為 Cu+，促使DLAT脂酰化，脂酰化DLAT進一步發生寡聚化造成蛋白應激誘導細胞死亡 [6]。但目前銅死亡機制仍有許多未解答的問題。首先，銅死亡的特征性表現尚未被描述，包括其細胞形態變化以及分子或細胞水平上的特征性變化[6]。其次，銅離子載體藥物，如抗腫瘤藥物伊利司莫（elesclomol，ELS）和治療酒精依賴藥物雙硫侖（disulfiram，DSF）[32-34]，均存在非DLAT寡聚化誘導的蛋白質毒性應激，例如ELS可通過FDX1降低鐵硫簇蛋白穩定性[10]，DSF則通過與核定位蛋白相互作用影響泛素化蛋白質降解途徑[35-36]。可見，銅死亡相關機制有待進一步完善，仍需要更多體內外研究明確上游調控途徑及下游通路。
2 CKGs與NSCLC相關性
在Tsvetkov等[6]的研究中，通過全基因組CRISPR敲除，成功鑒定出與銅死亡密切相關的10個基因，加上銅離子轉運相關基因（SLC31A1、ATP7A及ATP7B），構成了包含13個基因的CKGs。這些基因及對應轉錄翻譯蛋白在銅死亡過程中扮演了至關重要的角色。例如，FDX1通過將Cu從二價銅還原為一價銅，展現出顯著的細胞毒性和功能性增強[10]。同樣，CDKN2A、GLS和MTF1也被證實在細胞對銅死亡的敏感性中起著決定性作用[6]。進一步研究表明，SLC31A1、ATP7A和ATP7B等基因通過調節細胞內銅離子濃度，對銅死亡過程產生影響[6] 。其中，SLC31A1基因編碼的銅離子轉運蛋白1負責銅離子的細胞內轉運，而ATP7A編碼的ATP酶轉運酶α肽和ATP7B編碼的ATP轉運酶β肽則參與銅離子的細胞外排出，共同構成了細胞銅離子轉運的重要機制，直接影響著銅的細胞內外平衡[37-39] 。
隨著對CKGs在腫瘤學領域內的深入探索，越來越多的研究[40-44]開始聚焦于這些基因在不同類型腫瘤中的表達及其潛在預后價值。針對NSCLC，研究者基于CKGs以及相關lncRNA進行生物信息學分析，成功構建預后特征并顯示出良好的預測效果[17-18]。此外，腫瘤免疫微環境（TIME）與CKGs之間的關聯已引起廣泛關注。早期研究已經揭示，TIME與一系列調節細胞死亡過程，包括凋亡、鐵死亡、焦亡、壞死及自噬等，之間存在密切聯系[45-47]。在腫瘤環境中誘導這些炎癥性細胞死亡形式可能觸發損傷相關分子模式（DAMPs）和特定細胞因子的釋放，進而調節參與抗腫瘤免疫反應的先天性及適應性免疫細胞的功能。此外，基于鐵死亡[48]、焦亡[49-50]以及壞死[51]的分子亞型已被開發，在預測與患者預后及免疫治療療效上展現出一定的價值，因此基于CKGs的腫瘤分型也引起了廣泛的關注。在NSCLC中，不少研究對CKGs與TIME以及免疫治療之間的相關性進行研究，在基于CKGs相關基因集構建的風險評分中，高風險組患者表現出免疫抑制的TIME以及較差的免疫治療響應[15-16]。研究銅死亡相關基因簽名有助于從新的視角進行肺癌患者分型，對理解肺癌生物學至關重要，目前由于銅死亡機制尚未完全闡明，尚未能在體內外實驗中驗證已發表分子分型的有效性，同時還面臨數據質量、分析可重復性等挑戰，但有賴于大樣本數據的挖掘以及統計分析方法的迭代，可以部分克服上述困難，推動銅死亡及肺癌研究進展。
3 銅死亡與NSCLC常見靶點
Tsvetkov等[6]的研究揭示了銅死亡發生的機制，但是關于銅死亡的調控及靶點并未作進一步探索。在銅死亡過程中，過量銅離子直接與有氧呼吸TCA循環中的硫辛酰化蛋白結合，導致這些蛋白發生凝集、鐵硫簇蛋白降解，以及隨后的蛋白毒性應激和細胞死亡。因此，肺癌發生發展過程中的常見突變及靶點是否可以直接調控CKGs，或者是否能夠改變腫瘤細胞能量代謝途徑（有氧呼吸/糖酵解）從而調節腫瘤細胞對線粒體呼吸依賴的銅死亡的敏感性，這種銅死亡與NSCLC治療靶點間的串擾有望為肺癌治療提供新思路、新方法。
3.1 p53
50%的肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）會發生腫瘤抑制基因 TP53 的突變。p53可通過調節下游的靶基因 ，在肺癌的發生、發展、轉移中發揮作用。野生型TP53為抑癌基因，對肺癌細胞的生長起負性調節作用。突變型TP53則具有致癌活性，是肺部腫瘤形成的原因之一[52]。大量研究表明突變型p53通過多種機制增強糖酵解、抑制氧化磷酸化以及調節脂質代謝[53-54]。因此，突變型p53可能通過這些方式增強癌細胞對銅死亡抵抗，通過靶向p53的方式調控代謝重編程從而增強銅死亡敏感性有望成為肺癌治療的有效靶點。
3.2 KRAS
KRAS突變存在于高達35%的LUAD中，且大部分與吸煙相關。KRAS的激活點突變最常見于密碼子12（G12C、G12D、G12V和G12A），而密碼子13、10或61的激活點突變較少見[55]。谷氨酰胺轉化為TCA循環的中間體α-酮戊二酸以及線粒體產生的ROS對KRAS誘導的肺癌發生發展至關重要[56]，表明線粒體代謝在KRAS誘導的肺癌進展中發揮關鍵作用。同時，研究表明靶向抑制GLS（CKGs之一，編碼谷氨酰胺酶）可以協同增強塞魯美替尼對KRAS突變型NSCLC的抗腫瘤活性，這表明KRAS突變型NSCLC與谷氨酰胺代謝密切相關[57]，提示抑制銅死亡相關基因GLS可能是KRAS突變NSCLC的新靶點。另外一項結直腸癌中研究[58]表明，ATP7A在KRAS突變的結直腸癌細胞表面表達上調，進而調節KRAS突變細胞中的細胞內銅水平并促進腫瘤生長。在肺癌中，KRAS突變與銅離子轉運途徑的關系尚不明確，有待進一步探索。
3.3 表皮生長因子受體
表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是肺癌的致癌驅動因子，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）為EGFR突變陽性患者提供了有利的治療結果[59]。研究發現，接受TKIs治療的患者氧化磷酸化水平升高[60]，提示TKIs可能增加對銅死亡的敏感性。近期一項研究[61]進一步揭示了接受奧希替尼治療的NSCLC中NCOA4上調。NCOA4是鐵自噬中的關鍵蛋白，維持了線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關鐵硫簇蛋白的合成，這些蛋白合成和活性上調增強了腫瘤細胞對銅死亡的敏感性。此外，奧希替尼與ELS復合物治療顯著提高了奧希替尼的療效且沒有額外的毒性[61]。總之，針對EGFR TKIs耐藥的NSCLC患者，聯合誘導銅死亡治療是一種潛在的新療法。
3.4 PD-L1
程序性細胞死亡蛋白1/程序性細胞死亡受體1（PD-L1/PD-1）軸是肺癌免疫治療的主要治療靶點，針對PD-L1/PD-1免疫治療已顯示出良好的臨床效果，隨著全球首個肺癌新輔助免疫治療Ⅲ期臨床研究——checkmate816的結果問世，2023年第一版NCCN指南也將納武利尤單抗聯合含鉑雙藥化療方案正式納入指南[62]。然而，由于肺癌細胞的免疫逃逸環節眾多以及治療相關的副作用，免疫治療也存在一定局限性。Voli等[63]發現，銅離子螯合劑能夠抑制STAT3和EGFR的磷酸化，從而促進PD-L1泛素化降解，最終提高免疫治療的效果。也有研究報道銅死亡納米復合物可以重塑TIME，從而增強免疫治療療效，但是具體機制尚不明確，仍有待進一步研究[64]。
4 銅離子載體藥物在NSCLC治療中的應用
ELS和DSF是兩種臨床可及的銅離子載體藥物，具有抗癌活性。DSF能提高常規化療藥物的有效性，與多西他賽、阿霉素等聯合使用時具有協同作用。一項Ⅱ期隨機對照雙盲臨床研究評估了DSF聯合順鉑-長春瑞濱化療方案的安全性及有效性[65]。該研究納入了40例晚期NSCLC患者，DSF組相比對照組展現出顯著的總生存獲益（10.0個月 vs. 7.1個月，P=0.041），其中僅有的兩例長期存活患者均出現在DSF組，而這種生存獲益并沒有在其他一些癌種中得以體現[66]。盡管樣本量有限，但作為僅有的一項DSF用于NSCLC治療的臨床研究，其結果仍然顯示出DSF用于NSCLC治療的可能性。此外，DSF與Cu的復合物（DSF-Cu）進一步拓寬了銅離子載體藥物的應用。在乳腺癌小鼠模型中，DSF-Cu處理組中上調了PD-L1的表達，進而增強了腫瘤細胞對抗PD-1免疫治療的敏感性[67]。近期一項研究表明，當與放療結合時，DSF-Cu能誘導癌細胞中的免疫原性細胞死亡，增強效應T細胞的增殖和活化，從而抑制乳腺癌轉移[68]。還有許多正在開展的臨床研究探索DSF-Cu的不同治療方式。一項Ⅰ～Ⅱ期臨床研究正在評估圍術期使用DSF-Cu治療膠質母細胞瘤的療效（NCT02715609），其采用術前單用DSF-Cu新輔助治療以及術后DSF-Cu聯合放化療輔助治療方案，研究預計于2024年9月完成。另一項Ⅱ～Ⅲ期隨機對照臨床研究中并未提示DSF-Cu治療復發性膠質母細胞瘤患者的臨床獲益（NCT02678975），研究納入88例患者并進行1∶1隨機化，結果顯示額外的DSF-Cu治療并未取得顯著的生存獲益，卻同時增加了藥物毒性[69]。綜上，DSF的臨床前研究提供了DSF協同已有腫瘤治療方式的理論基礎，且相比于膠質母細胞瘤，DSF治療已經在NSCLC患者中觀察到一定程度的生存獲益，未來有望通過進一步臨床研究探索DSF/DSF-Cu在NSCLC患者治療中的應用。
ELS是另一種銅離子載體藥物，在誘導銅死亡的專一性方面優于DSF，但其由于特殊的藥代動力學，其體內效應較DSF更弱[6]。一項已完成的臨床研究評估Ⅲb期/Ⅳ期NSCLC患者采用ELS聯合卡鉑加紫杉醇化療方案的安全性及有效性（NCT00088088），但結果并未報道。此外，還有多項早期試驗正在進行或已完成但尚未報告結果，臨床試驗結果的報告可能因各種因素而延遲。近年來，越來越多基于納米材料的ELS-Cu復合物在臨床前動物模型中驗證了有效性[64, 70-71]，在精準殺傷腫瘤細胞的同時促進了TIME的重塑，從而增強免疫治療療效。
由此可見，銅離子載體藥物在改善腫瘤治療方面具有巨大潛力，未來需進一步研究其在NSCLC治療中應用以及相關藥物的開發，使得精準誘導肺癌細胞銅死亡并協同增強已有治療方案成為可能。
5 未來及展望
盡管有許多臨床前及臨床研究初步探索了銅離子載體藥物的療效，銅死亡機制的完善仍是其在肺癌治療應用中的基石。基于目前金屬生物化學及腫瘤代謝檢測領域的豐富經驗，已有技術能夠為腫瘤中銅死亡的直接或間接檢測提供參考。銅穩態在腫瘤中的直接或間接觀測，對于識別銅依賴性細胞死亡—即銅死亡—發揮著至關重要的作用。例如，Tsvetkov等[6]利用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）量化細胞中銅濃度，在其關于銅死亡的研究中展示了離子載體如何將銅運輸進入細胞。另外，監測分子生化水平的產物可以識別銅死亡的發生。銅死亡的一個特征是Cu+與TCA循環中涉及的脂酰化線粒體酶（如DLAT）結合，誘發這些蛋白的聚集。因此，監測脂酰化蛋白的寡聚化可以判斷是否發生銅死亡。在探索銅死亡機制過程中，Tsvetkov等[6]采用免疫印跡來監測脂酰化DLAT的寡聚化，并使用共聚焦免疫熒光成像直接觀察其寡聚體的形成以及與線粒體膜的共定位情況。而通過免疫印跡或免疫組化/免疫熒光檢測銅死亡上游調節分子（如LIAS、FDX1和鐵硫簇蛋白）的表達水平變化，則間接證明了銅死亡的發生。然而，目前缺乏可靠的形態學變化作為銅死亡的指標，需要進一步的研究來提供更有效的分子標志物。
與其他癌癥相比，肺癌細胞線粒體代謝水平更高，耐藥性更強，這可能有利于今后誘導銅死亡治療，取得更好的療效。銅離子載體與肺癌常用化療藥物或免疫治療的結合也是未來可能的應用方向。綜上所述，銅死亡在肺癌治療中具有光明的前景，然而銅死亡發生的機制以及銅死亡與肺癌的聯系仍需進一步研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：董懂負責文章撰寫和語言修改；張亞杰負責問文章語言修改及內容調整；李鶴成負責文章質量監督和總體設計。