引用本文： 周林巖, 李勇男, 蔣祥彥, 李鑒, 焦作義. 譜系示蹤技術在肝再生中的應用研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2024, 31(4): 487-494. doi: 10.7507/1007-9424.202311044 復制
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肝臟在營養代謝、解毒、調節凝血因子和膽汁合成方面起著至關重要的作用，但它易受到不同程度的損傷；同時肝臟也是一個具有高度再生潛力的器官[1]。肝再生是一個復雜的多種細胞相互調控的生物學過程，對此過程的研究顯得至關重要。譜系示蹤技術是一種基于基因編輯和遺傳標志標記特定細胞群體并追蹤它分化、增殖和遷移過程的技術[2]。通過使用譜系示蹤技術可更好地了解肝再生過程，為未來肝臟疾病的治療和再生醫學研究提供深刻見解，為患者帶來新的希望和機遇。
1 譜系示蹤技術
在20世紀初Conklin[3]通過對比發現海鞘胚胎早期有絲分裂過程的顏色不同，此發現被認為是譜系示蹤技術的開端。到了20世紀70年代，Cheng[4]為了研究發育成熟的腸內分泌細胞的分化模式，將腸內分泌細胞使用鐵蘇木精和3H-胸腺進行染色并通過電子顯微鏡示蹤其分化模式，然而發現了細胞染色的不準確性，從而限制了該技術的進一步應用。隨著技術的進一步發展，到了21世紀初，Mio等[5]使用延時攝影技術成功地觀察到了胚胎及其發育過程，之后該技術被廣泛應用于胚胎動力學的研究，用以觀察胚胎發育過程中的變化。近年來，有研究者[6]通過探針物理注射各種染料到細胞中來觀察標記和未標記細胞之間的表達差異，然而結果發現，隨著標記細胞的逐漸增殖，外源性標志物會逐步被稀釋，因此使它無法更加有效地標記子代細胞。近十年來，環化重組酶（cyclization recombination enzyme，Cre）介導的譜系示蹤技術逐漸興起，極大地提高了示蹤的準確性和完整性，現已被廣泛應用于器官再生及疾病模型的研究[7-9]。如今已誕生出許多更加可靠且先進的譜系示蹤技術如原位雜交技術（in situ hybridization，ISH）、基因靶向技術、單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術、DNA條形碼技術等，這些技術在觀察器官形成、研究組織損傷和器官再生中占據越發重要的地位[10-12]，各種技術的優缺點見表1。下面對譜系示蹤技術最新進展進行綜述。
表1
多種譜系示蹤相關技術的優缺點
1.1 ISH
顧名思義，ISH的“原位”意味著在生物樣本的原始位置進行研究而不需要分離或提取DNA或RNA；“雜交”是通過將標記的探針（通常是標記有熒光染料或放射性同位素的DNA或RNA片段）與待研究的生物樣本中的互補DNA或RNA序列結合來實現，這些探針可以識別特定的基因、RNA或蛋白質[13]。ISH通常用于研究基因表達、基因組結構、染色體分析、病毒檢測等領域。ISH是一種生物分子學技術，用于檢測和定位細胞或組織中特定核酸序列的存在和定位，而譜系示蹤技術則可以追蹤這些細胞及其后代在生物體內的行為，二者結合可以更全面地理解特定基因如何影響細胞的行為和命運。有研究者[14]通過使用ISH對轉基因小鼠誘導的肝纖維化模型進行研究發現，小鼠肝臟內皮中轉錄因子Gata4通過防止血管分泌信號傳導的致病性轉換來控制肝纖維化和再生，提示ISH技術對研究肝纖維化及肝再生提供了可靠的技術支持。
1.2 基因靶向技術
基因靶向技術是一組生物技術方法，用于精確地編輯或修改生物體的基因。在譜系示蹤技術中，基因靶向技術被用來引入細胞譜系標記，例如使用基因靶向技術CRISPR-Cas9精確地將熒光標記基因插入至特定細胞的基因組，從而實現對這些細胞及其后代的追蹤。基因靶向技術允許選擇性地添加、刪除或更改一個生物體的基因，以實現特定的目標[15]。Cre-loxP重組酶系統和Dre-rox重組系統是目前最常用的基因靶向技術[16-17]。
通用的Cre-loxP重組酶系統由于其簡單和高效的特點，已被廣泛用于精確操縱哺乳動物細胞和轉基因動物的基因組，如細胞命運圖譜[18-19]、基因組工程[20]和疾病治療[21]，它主要由Cre和loxP序列兩個關鍵部分組成。Cre能夠識別并在loxP序列兩側引發DNA重組，催化兩對稱為loxP位點的34個堿基序列之間的同源DNA重組，以實現特定的遺傳操作，如基因敲除、激活或基因特定部分的插入[22-23]。Cre-loxP重組酶系統的應用非常廣泛，特別在小鼠模型[24]中，它在ROSA26小鼠（ROSA26是一個位于小鼠6號染色體上由3個外顯子構成的非編碼基因）中用于產生mT/mG小鼠（該品系在膜定位的 tdTomato盒兩側具有loxP位點并在檢測所有組織和細胞類型中表達強紅色熒光），其中細胞可以根據其身份用不同的熒光標記，從而大大提高示蹤劑的分辨率[25]。Cre-loxP重組酶系統可以用于精確控制在特定細胞類型或組織中基因的表達或操縱，從而有助于研究基因功能、細胞譜系追蹤、疾病模型的建立等多個領域，該系統的靈活性和特異性使它成為生命科學研究中的強大工具。但是該技術也存在其局限性，有研究者[22]報道，Cre-loxP技術可與他莫昔芬等化學試劑相結合，可以達到控制基因組工程時間的目的，然而細胞毒性、泄漏、非特異性重組、對高時空分辨率系統的有限控制等問題使得化學誘導的Cre-loxP重組酶系統面臨巨大挑戰。有研究者[26]利用紫外線和藍光系統具有光毒性且對深層組織穿透能力有限這一特點，同時基于細菌光敏系統和分裂Cre開發了一種遠紅光誘導的分裂Cre-loxP重組酶系統，在肝臟中展現了優于之前Cre誘導系統的表現，這一發現豐富了Cre-loxP重組酶系統中光遺傳學工具箱，實現它在活體系統中完成時空受控及無創的基因工程，同時也為探索肝再生提供了更加可靠的生物模型。
Dre-rox重組系統是一種基因重組系統，類似于Cre-loxP重組酶系統，用于精確操控DNA中的特定基因片段。該系統主要包括兩個關鍵組成部分Dre酶與rox序列，Dre酶能夠識別并在rox位點兩側引發DNA的重組，從而實現對目標基因的遺傳修飾。Dre-rox重組系統在基因編輯、譜系示蹤等研究中具有重要的應用潛力。研究[27]發現，通過將Dre-rox重組系統與Cre-loxP重組酶系統結合使用，可實現更高程度的遺傳精確控制，從而更好地了解基因功能和細胞譜系；這兩種重組系統的組合可以更加有效且精準地發現靶向器官，探索各種器官發育和自身損傷修復機制，甚至理解體內干細胞的強大可塑性[28]，在研究肝再生細胞來源中起到了重要的作用。除了上述應用之外，這種雙酶激活的譜系追蹤方法為哺乳動物中精確定位基因提供了可行性，該系統的開發為生物學研究提供了更多工具和方法，以更好地理解和調控基因組。
1.3 DNA條形碼技術
DNA條形碼是一種強大的用于識別和發現物種的分類學工具，該技術的基本思想是使用一段標準化的DNA序列作為物種的唯一識別標志（類似于商業上使用的商品條形碼）。DNA條形碼利用一個或多個標準化的短DNA片段進行分類鑒定。隨著新的測序技術的出現，如下一代測序、Ont Minion孔道測序和PacBio測序，DNA條形碼變得更加準確、快速和可靠，尤其在大規模樣本處理和高通量測序技術的支持下，DNA條形碼技術變得更加強大和應用廣泛。通過DNA條形碼的快速物種鑒定已經在多個領域得到應用，包括法醫科學、疾病研究[29]。Xie等[30]的團隊基于基因靶向技術CRISPR編輯的譜系特異性示蹤（CRISPR editing-based lineage-specific tracing，CREST）方法，在Cre小鼠中進行克隆示蹤，并使用基于CREST的兩種互補策略來繪制發育中的小鼠腹側中腦的單細胞譜系，之后通過應用snapshotting CREST構建了小鼠腹側中腦發育的時空譜系景觀，進一步創建了“panda CREST”（前體和衍生物相關的CREST），通過該方法確定了多源多巴胺能神經元的起源，并證明了一個以轉錄組定義的具有不同的克隆命運和分子特征的包括異質的前體的前體類型。DNA條形碼技術通過提供獨特的分子標簽來增強譜系示蹤的精度，而譜系示蹤技術可以在DNA條形碼標記的基礎上提供更詳細的細胞行為信息，二者結合可以提供關于細胞行為和命運的更全面和精確的理解，目前這一技術被廣泛用于再生細胞的追蹤，但是在肝再生領域的應用還有待進一步探索。
1.4 scRNA-seq技術
scRNA-seq技術是一種常見的分子生物學技術，它允許在單個細胞級別分析生物樣本中的基因表達情況，可以揭示細胞的分子特征，而譜系示蹤技術可以提供這些分子變化如何隨時間在細胞群體中傳播的動態信息，二者的組合對于理解復雜生物過程（如器官發育、疾病進程及腫瘤發生）至關重要。傳統的RNA測序技術通常是在整個細胞群體中進行，而scRNA-seq則允許深入了解每個細胞的基因表達模式，揭示不同細胞之間的差異和多樣性。scRNA-seq技術在器官再生研究中也取得了巨大的進步。相關研究[31]利用scRNA-seq技術來研究急性對乙酰氨基酚中毒后小鼠肝再生的動力學發現，位于再生前沿的肝細胞亞群在重編程到中心周圍狀態時會短暫上調胎兒特異性基因如甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和細胞黏附分子-17（cadherin-17，CDH17），其中內皮細胞、肝星狀細胞和巨噬細胞群體在免疫募集、增殖和基質重塑中有不同的參與；還有研究[32]通過scRNA-seq技術發現，多巴胺受體D2拮抗作用選擇性靶向巨噬細胞與結締組織生長因子、血管細胞黏附蛋白1及血管生態位之間的Yes相關蛋白依賴性纖維化串擾，促進嚙齒動物和大型動物模型中肝再生而不是纖維化。
2 譜系示蹤技術在肝再生中的應用
2.1 在鑒定肝再生細胞來源中的應用
肝細胞損傷后的再生細胞來源一直是研究的焦點。通過譜系示蹤技術揭示肝再生細胞為肝臟健康和治療肝臟疾病提供了新的希望。目前關于損傷后肝細胞的來源存在部分爭議。與存在干細胞或祖細胞的皮膚組織和腸上皮組織不同，肝再生過程中是否存在肝祖細胞尚無共識[33]。20世紀50年代中期，在利用對乙酰氨基熒光治療的大鼠中發現了位于膽管末端分支的Hering管中出現的橢圓形細胞，隨后的研究中將這種橢圓形細胞描述為增生上皮細胞，其特點為細胞體積小、核/漿比高，并且表達肝細胞標志物AFP，橢圓形細胞在體外表現出向肝細胞和膽管細胞分化的能力，因此被認為是雙向分化祖細胞[34]，該細胞也被報道為人類慢性肝臟疾病的肝祖細胞，其數量與疾病嚴重程度相關。然而由于缺乏針對橢圓形細胞的特異性標志物以及2-乙酰氨基芴/部分肝切除模型在小鼠中的不適用性，迄今為止，在任何經典小鼠損傷模型中仍缺乏直接的體內證據表明橢圓形細胞能夠產生成熟的肝細胞和膽管細胞。
近年來通過體外培養、肝再生試驗和譜系示蹤研究了肝祖細胞[35-37]。在AhCre+Mdm2flox/flox小鼠模型中使用肝細胞譜系追蹤檢測到肝祖細胞的激活，在肝細胞廣泛受損時，上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）＋CD24＋CD133＋肝祖細胞移植可恢復AhCre+Mdm2flox/flox小鼠受損的肝臟[38]。此外，Aizarani等[39]通過scRNA-seq和類器官培養，在人肝臟中鑒定出EpCAM＋TROP2intCK19low祖細胞，具有較強的類器官形成能力。
盡管通過體外培養和細胞移植已經確定了這些肝細胞亞群的功能，但它們在體內穩態和肝損傷下的功能仍有待確定，需要通過結合空間轉錄組和scRNA-seq或通過譜系追蹤研究來進一步表現這些細胞亞群。Furuyama等[40]應用譜系追蹤方法發現，膽管細胞特異基因Sox9IRES-CreERT2敲入小鼠細胞系中，在穩態和四氯化碳、膽總管結扎或酒精乙二酰鹽、亞硝胺、巴石松、髓樣組織破碎物飲食誘導的肝損傷下，表達Sox9的細胞對肝再生有顯著影響；而Tarlow等[41]則發現，在使用BAC轉基因Sox9-CreERT2小鼠中肝細胞極少來自Sox9+細胞。Qin等[42]通過研究Sox9敲除小鼠發現，Sox9作為一種重要的轉錄因子，直接與小型異二聚體伴侶啟動子結合以調節其轉錄，此外，Sox9通過抑制小型異二聚體伴侶信號傳導和改善線粒體功能來改善急性肝損傷的機制。以上這些研究之間的差異可能是由于Sox9基因標記小鼠工具中啟動子的特異性和敏感性差異。盡管肝祖細胞的存在仍存在爭議，但這些細胞亞群的研究為肝再生的機制提供了新的線索。未來的研究將繼續關注這些潛在的再生細胞來源，以期更全面地了解肝再生過程，從而為肝臟疾病的治療具有潛在的可能性。
2.2 在肝再生區域鑒定中的應用
肝細胞約占肝臟總細胞數的70%，在生理條件下以緩慢的速度進行自我更新。肝細胞高度多樣化，具有不同的功能和代謝表達特征，沿著門-中央軸存在不同的代謝分區[43]。根據肝細胞的代謝特征大致可分為3個區域（這些區域被稱為代謝分區），鄰近門靜脈的肝細胞被稱為第一區，可接觸到由肝動脈和門靜脈分別輸送的高濃度氧和營養物質的血液；靠近中央靜脈的肝細胞屬于第三區，在這里進行糖酵解、谷氨酰胺合成和異物代謝；第二區位于上述兩個區域之間[44]。
scRNA-seq結合空間重建對肝臟基因的表達模式和細胞群分區提供了可靠的研究依據。通過標記肝細胞亞群進行的譜系示蹤研究揭示了它們在穩態和肝再生期間在肝小葉中的特定分布，如Mfsd2a+肝細胞和混合型肝細胞位于第一區，而Axin2+肝細胞主要位于第三區，端粒體酶高表達（high telomerase expression，TERThigh）肝細胞散布于肝小葉中。
在穩態下，肝細胞自我復制有助于維持肝功能和質量[45]。Lgr5+/Axin2+肝細胞在許多組織中被認為是利用Wnt/β-catenin信號通路來維持其高增殖能力的組織干細胞[46]。相關研究[47]表明，在Wnt敲除的肝細胞中觀察到了肝細胞再生受損，還發現表達Wnt2和Wnt9b的內皮細胞缺失導致3區β-catenin靶標的丟失，從而破壞了肝臟分區過程中的動態性；同時肝細胞在中央門區呈現出Wnt/β-catenin信號梯度，在這個梯度中Lgr5和Axin2在中央門區肝細胞中共同表達[48]。Wang等[49]使用在內源性Axin2基因啟動子控制下表達Cre-ERT2的Axin2－ Cre-ERT2小鼠證明Axin2+ 肝細胞是一個自我更新的細胞群，它們在穩態期間的1年內擴展到整個肝臟面積的30%，以取代其他肝細胞亞群；然而另一項研究[50]使用細菌人工染色體轉基因小鼠來追蹤Axin2+細胞，顯示門區Axin2+肝細胞在增殖能力上與其他肝細胞亞群沒有顯著差異。
有研究發現，在慢性門區肝損傷中，混合型肝細胞和Mfsd2a+肝細胞受到嚴重影響，而中央小葉和中央門區肝細胞，特別是TERThigh肝細胞，有助于肝細胞再生。如Font-Burgada等[51]研究了門區肝細胞的貢獻，鑒定出一種混合型門區肝細胞亞群，這些亞群細胞同時表達成熟肝細胞標志物肝細胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）4α和低水平的膽管細胞特異基因Sox9，盡管混合型肝細胞在損傷后對肝細胞再生有貢獻，但在生理條件下混合型肝細胞的比例仍保持在約4.5%左右；此外，另一種門區亞群Mfsd2a+肝細胞的比例從6周時的40%下降到20周時的20%，然后在穩態下保持穩定[52]。在慢性中央門區損傷中，TERThigh、混合型肝細胞和Mfsd2a+肝細胞顯著增殖和擴張，以重新填充肝臟，如有研究者[53]發現TERThigh肝細胞亞群在肝小葉中隨機分布，在穩態期間經歷了10倍的擴增，提示門區肝細胞在穩態期間發揮有限作用。此外，有研究者在2個獨立的研究小組利用多種遺傳譜系示蹤方法徹底探究了3個區域的肝細胞的增殖能力，如He等[54]開發了一個雙重重組酶介導的遺傳系統，包括DreER、Ki67-CrexER和R26-GFP報告基因，用于在給定時間窗口內連續記錄細胞增殖，發現第二區的肝細胞比第三區和第一區的肝細胞具有更高的增殖率；Wei等[55]在14個 CreER基因敲入小鼠模型中進行了譜系示蹤，標記了不同區域的肝細胞亞群，并發現第2區的肝細胞是維持穩態再生和修復的主要貢獻者。這些研究進一步證明了在穩態下，肝細胞在不同區域具有不同的增殖能力，肝細胞的自我復制對于維持肝功能和質量至關重要，尤其是中央小葉肝細胞對穩態再生的貢獻最大，這對于深入了解肝功能的維持和修復過程具有重要意義。
2.3 在研究肝損傷后再生機制中的應用
肝損傷根據發生的時間分為急性和慢性損傷，而不同類型的損傷導致的再生途徑也不同[56]。肝再生是通過不同肝細胞增殖而來。在一項研究[50]中通過譜系示蹤技術發現，二倍體的Axin2周圍肝細胞負責維持肝臟穩態更新，整個肝臟中正在增殖的肝細胞不僅是Axin2周圍肝細胞，此結果提示，肝細胞的增殖能力廣泛分布，而不僅局限于罕見的干細胞樣群體[57]。此外，有研究[58]在由肝切除術和各類疾病導致的黃疸等引起的急性肝損傷中發現，肝再生是通過肝細胞增殖完成。通過scRNA-seq技術研究了急性對乙酰氨基酚中毒后小鼠肝再生的動態過程發現，肝細胞在整個肝小葉中增殖，并且產生快速重新填充壞死中心周區所需的有絲分裂壓力，位于再生前沿的肝細胞亞群在重編程到中心周狀態時會短暫上調胎兒特異性基因，包括AFP和CDH17，同時發現肝臟內的其他細胞在免疫募集、增殖和基質重塑中分別發揮各自的作用[31]。最近Wen等[59]對使用Cre-loxp酶系統處理的小鼠進行肝切除術后發現，白介素-33可通過腸-肝軸釋放五羥色胺促進肝再生。此外Lin等[60]采用譜系追蹤對正在分裂的肝細胞進行成像，以估計再生過程中有絲分裂錯誤的頻率，排除了來自非肝細胞來源的再生，發現多倍體肝細胞在慢性損傷期間能夠保持再生肝組織的能力而不產生有絲分裂錯誤，并且在肝硬化的肝臟中通常觀察不到非整倍體，增加多倍體肝細胞數量可增加肝再生能力。結合Matsumoto等[61]使用四色熒光譜系示蹤技術結合流式細胞分選技術的研究，發現多倍體肝細胞在原位具有廣泛的再生能力，并在再生響應期間經常經歷還原有絲分裂，同時在肝損傷修復過程中多倍體肝細胞可以增殖，而一些肝細胞則表現出減少的二倍體狀態。早期的研究發現，肝損傷將導致HNF1同源框β（HNF1 homeobox β，HNF1β）對于肝祖細胞的增殖和肝細胞的再生，尤其是慢性肝損傷后。Rodrigo-Torres等[62]通過誘導小鼠產生急性或慢性肝損傷并使用攜帶黃色熒光蛋白基因小鼠追蹤HNF1β+ 膽管細胞的譜系發現，HNF1β+ 膽管細胞是肝祖細胞的起源，肝損傷后可分化為有助于肝再生的肝細胞。肝祖細胞通常是靜態的，在肝損傷發生時它被激活并分化為肝細胞和膽管上皮細胞，以支持肝再生和維持肝功能[63]。此外，Choi等[64]通過使用Cre-loxp酶系統處理的熒光斑馬魚來跟蹤肝細胞的譜系，發現膽管上皮細胞可轉分化并增殖為肝細胞，從而促進了肝再生。Pu等[65]通過雙遺傳譜系追蹤方法鑒定并特異性標記了一種起源于膽管上皮細胞的過渡性肝祖細胞，可在嚴重肝損傷再生過程中分化為肝細胞，發現通過Notch和Wnt/β-catenin信號轉導分別協調了膽管上皮細胞到過渡性肝祖細胞和過渡性肝祖細胞到肝細胞的轉換，此研究為轉分化輔助肝再生提供了功能和機制見解。這些研究結果提示，肝組織修復和再生功能可受到多種器官及組織調控，不僅局限于肝內，同時這一修復與再生過程也不單一局限于干細胞群體，成熟的肝細胞和膽管上皮細胞也表現出一定的再生潛力。
病毒感染作為一種常見的慢性肝損傷，是全球肝癌的主要原因，其中乙型肝炎病毒感染是最常見的致病因子之一。有研究者[66]利用譜系示蹤技術對人肝細胞癌生物樣本進行轉錄組測序發現，多聚腺苷酸結合蛋白3、缺氧誘導因子1α、核糖體蛋白 S6 激酶 A3等基因與乙型肝炎病毒的感染密切相關。同時譜系示蹤技術也被用于探索與乙型肝炎病毒感染相關的信號通路對疾病進展的影響[67]。早期研究發現，使用Cre-loxP系統特異性敲除Mdm2基因，可以導致肝細胞的凋亡和壞死，從而影響肝再生。通過對乙型肝炎病毒相關肝細胞癌的綜合蛋白質基因組學研究[68]分析發現，與細胞周期調控相關的Mdm2/p53通路發生變化，提示乙型肝炎病毒相關肝損傷與胰島素樣生長因子+、AFP+、EpCAM+ 這3類的肝祖細胞表型顯著相關，可能激活肝祖細胞增殖，從而介導肝損傷修復和肝再生。此外，有研究[69]顯示，受Ras/絲裂原活化蛋白激酶信號控制的絲氨酸反應因子（serum response factor，SRF）被用作譜系示蹤的靶標，在SRF-VP16小鼠中發展成了肝細胞癌，這也進一步表明Ras/絲裂原活化蛋白激酶信號通路在肝細胞癌中是高度致癌的通路。
總體而言，譜系示蹤技術為肝再生研究提供了有力的工具，更有助于全面且系統地了解肝損傷修復的機制，為相關疾病的治療和預防提供了新的見解和潛在的可能性。然而盡管已取得了重要的研究進展，但仍需進一步的研究來深入探討不同類型的肝損傷和再生機制的復雜性。
3 總結與展望
肝再生是一個復雜而重要的生理過程，對于維護身體的正常代謝和生理功能至關重要。譜系示蹤技術已在肝再生研究中取得了較大進展，為深入了解肝再生機制提供了強大的工具。研究人員通過譜系示蹤技術已揭示了肝臟中不同亞群肝細胞在穩態和損傷條件下的分布、再生過程和轉分化機制，具體來說，譜系示蹤技術已揭示了以下關鍵發現：① 肝臟中不同類型肝細胞在肝小葉內有特定的分布，譜系示蹤能幫助了解它們在肝臟結構中的位置和功能；② 肝細胞的再生主要通過代償性增殖來實現，譜系示蹤揭示了不同亞群肝細胞的再生潛力和貢獻；③ 在慢性肝損傷條件下，肝細胞和膽管細胞之間的轉分化現象已被證實，這一過程得到了譜系示蹤技術的支持；④ Wnt/β-catenin、Hippo/Yes相關蛋白和Notch信號通路在肝再生中扮演關鍵角色，譜系示蹤幫助了解這些信號通路的具體作用。
盡管譜系示蹤技術在肝再生研究中具有許多優勢，但也需認識到其局限性，包括：① 標志特異性的挑戰。譜系示蹤技術通常需使用特定的標志物或遺傳編輯方法來標記目標細胞群體，然而在肝再生中，不同類型的細胞可能具有相似的表型或表面標志，這可能導致標志特異性不足，使得難以準確追蹤特定的細胞群體。② 時間和成本。進行譜系示蹤實驗通常需大量的時間和資源，需要培養和維護動物模型或細胞系進行標記和監測，以及進行數據分析，這可能會導致研究周期較長且成本較高。③ 動物模型的限制。在研究肝再生時，通常需使用動物模型如小鼠，然而小鼠和人類之間存在生物學差異，因此研究結果在轉化到人類臨床應用時可能存在局限性。④ 無法解決所有問題。譜系示蹤技術主要用于追蹤細胞的命運和分化，但它不能解決所有關于肝再生機制的問題，其他技術如scRNA-seq和功能實驗也需結合使用，以全面理解肝再生的復雜過程。⑤ 倫理和法律問題。使用動物模型進行研究可能引發倫理和法律問題，特別是在涉及基因編輯或干細胞治療等高風險技術時。盡管如此，隨著譜系示蹤技術的不斷進步，仍可期待更深入、更全面的研究，以揭示肝再生機制的更多細節，這將有助于開發新的治療策略，改善肝臟疾病的治療效果，并為器官再生研究領域提供更多有關細胞命運和分化的見解。譜系示蹤技術將繼續在肝再生研究中發揮重要作用，為未來的醫學和生物學研究提出更多機會和挑戰。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：周林巖負責文獻檢索、撰寫論文與修改；李鑒、李勇男和蔣祥彥參與稿件修改及定稿；焦作義參與論文選題和設計并給予指導。
肝臟在營養代謝、解毒、調節凝血因子和膽汁合成方面起著至關重要的作用，但它易受到不同程度的損傷；同時肝臟也是一個具有高度再生潛力的器官[1]。肝再生是一個復雜的多種細胞相互調控的生物學過程，對此過程的研究顯得至關重要。譜系示蹤技術是一種基于基因編輯和遺傳標志標記特定細胞群體并追蹤它分化、增殖和遷移過程的技術[2]。通過使用譜系示蹤技術可更好地了解肝再生過程，為未來肝臟疾病的治療和再生醫學研究提供深刻見解，為患者帶來新的希望和機遇。
1 譜系示蹤技術
在20世紀初Conklin[3]通過對比發現海鞘胚胎早期有絲分裂過程的顏色不同，此發現被認為是譜系示蹤技術的開端。到了20世紀70年代，Cheng[4]為了研究發育成熟的腸內分泌細胞的分化模式，將腸內分泌細胞使用鐵蘇木精和3H-胸腺進行染色并通過電子顯微鏡示蹤其分化模式，然而發現了細胞染色的不準確性，從而限制了該技術的進一步應用。隨著技術的進一步發展，到了21世紀初，Mio等[5]使用延時攝影技術成功地觀察到了胚胎及其發育過程，之后該技術被廣泛應用于胚胎動力學的研究，用以觀察胚胎發育過程中的變化。近年來，有研究者[6]通過探針物理注射各種染料到細胞中來觀察標記和未標記細胞之間的表達差異，然而結果發現，隨著標記細胞的逐漸增殖，外源性標志物會逐步被稀釋，因此使它無法更加有效地標記子代細胞。近十年來，環化重組酶（cyclization recombination enzyme，Cre）介導的譜系示蹤技術逐漸興起，極大地提高了示蹤的準確性和完整性，現已被廣泛應用于器官再生及疾病模型的研究[7-9]。如今已誕生出許多更加可靠且先進的譜系示蹤技術如原位雜交技術（in situ hybridization，ISH）、基因靶向技術、單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術、DNA條形碼技術等，這些技術在觀察器官形成、研究組織損傷和器官再生中占據越發重要的地位[10-12]，各種技術的優缺點見表1。下面對譜系示蹤技術最新進展進行綜述。
表1
多種譜系示蹤相關技術的優缺點
1.1 ISH
顧名思義，ISH的“原位”意味著在生物樣本的原始位置進行研究而不需要分離或提取DNA或RNA；“雜交”是通過將標記的探針（通常是標記有熒光染料或放射性同位素的DNA或RNA片段）與待研究的生物樣本中的互補DNA或RNA序列結合來實現，這些探針可以識別特定的基因、RNA或蛋白質[13]。ISH通常用于研究基因表達、基因組結構、染色體分析、病毒檢測等領域。ISH是一種生物分子學技術，用于檢測和定位細胞或組織中特定核酸序列的存在和定位，而譜系示蹤技術則可以追蹤這些細胞及其后代在生物體內的行為，二者結合可以更全面地理解特定基因如何影響細胞的行為和命運。有研究者[14]通過使用ISH對轉基因小鼠誘導的肝纖維化模型進行研究發現，小鼠肝臟內皮中轉錄因子Gata4通過防止血管分泌信號傳導的致病性轉換來控制肝纖維化和再生，提示ISH技術對研究肝纖維化及肝再生提供了可靠的技術支持。
1.2 基因靶向技術
基因靶向技術是一組生物技術方法，用于精確地編輯或修改生物體的基因。在譜系示蹤技術中，基因靶向技術被用來引入細胞譜系標記，例如使用基因靶向技術CRISPR-Cas9精確地將熒光標記基因插入至特定細胞的基因組，從而實現對這些細胞及其后代的追蹤。基因靶向技術允許選擇性地添加、刪除或更改一個生物體的基因，以實現特定的目標[15]。Cre-loxP重組酶系統和Dre-rox重組系統是目前最常用的基因靶向技術[16-17]。
通用的Cre-loxP重組酶系統由于其簡單和高效的特點，已被廣泛用于精確操縱哺乳動物細胞和轉基因動物的基因組，如細胞命運圖譜[18-19]、基因組工程[20]和疾病治療[21]，它主要由Cre和loxP序列兩個關鍵部分組成。Cre能夠識別并在loxP序列兩側引發DNA重組，催化兩對稱為loxP位點的34個堿基序列之間的同源DNA重組，以實現特定的遺傳操作，如基因敲除、激活或基因特定部分的插入[22-23]。Cre-loxP重組酶系統的應用非常廣泛，特別在小鼠模型[24]中，它在ROSA26小鼠（ROSA26是一個位于小鼠6號染色體上由3個外顯子構成的非編碼基因）中用于產生mT/mG小鼠（該品系在膜定位的 tdTomato盒兩側具有loxP位點并在檢測所有組織和細胞類型中表達強紅色熒光），其中細胞可以根據其身份用不同的熒光標記，從而大大提高示蹤劑的分辨率[25]。Cre-loxP重組酶系統可以用于精確控制在特定細胞類型或組織中基因的表達或操縱，從而有助于研究基因功能、細胞譜系追蹤、疾病模型的建立等多個領域，該系統的靈活性和特異性使它成為生命科學研究中的強大工具。但是該技術也存在其局限性，有研究者[22]報道，Cre-loxP技術可與他莫昔芬等化學試劑相結合，可以達到控制基因組工程時間的目的，然而細胞毒性、泄漏、非特異性重組、對高時空分辨率系統的有限控制等問題使得化學誘導的Cre-loxP重組酶系統面臨巨大挑戰。有研究者[26]利用紫外線和藍光系統具有光毒性且對深層組織穿透能力有限這一特點，同時基于細菌光敏系統和分裂Cre開發了一種遠紅光誘導的分裂Cre-loxP重組酶系統，在肝臟中展現了優于之前Cre誘導系統的表現，這一發現豐富了Cre-loxP重組酶系統中光遺傳學工具箱，實現它在活體系統中完成時空受控及無創的基因工程，同時也為探索肝再生提供了更加可靠的生物模型。
Dre-rox重組系統是一種基因重組系統，類似于Cre-loxP重組酶系統，用于精確操控DNA中的特定基因片段。該系統主要包括兩個關鍵組成部分Dre酶與rox序列，Dre酶能夠識別并在rox位點兩側引發DNA的重組，從而實現對目標基因的遺傳修飾。Dre-rox重組系統在基因編輯、譜系示蹤等研究中具有重要的應用潛力。研究[27]發現，通過將Dre-rox重組系統與Cre-loxP重組酶系統結合使用，可實現更高程度的遺傳精確控制，從而更好地了解基因功能和細胞譜系；這兩種重組系統的組合可以更加有效且精準地發現靶向器官，探索各種器官發育和自身損傷修復機制，甚至理解體內干細胞的強大可塑性[28]，在研究肝再生細胞來源中起到了重要的作用。除了上述應用之外，這種雙酶激活的譜系追蹤方法為哺乳動物中精確定位基因提供了可行性，該系統的開發為生物學研究提供了更多工具和方法，以更好地理解和調控基因組。
1.3 DNA條形碼技術
DNA條形碼是一種強大的用于識別和發現物種的分類學工具，該技術的基本思想是使用一段標準化的DNA序列作為物種的唯一識別標志（類似于商業上使用的商品條形碼）。DNA條形碼利用一個或多個標準化的短DNA片段進行分類鑒定。隨著新的測序技術的出現，如下一代測序、Ont Minion孔道測序和PacBio測序，DNA條形碼變得更加準確、快速和可靠，尤其在大規模樣本處理和高通量測序技術的支持下，DNA條形碼技術變得更加強大和應用廣泛。通過DNA條形碼的快速物種鑒定已經在多個領域得到應用，包括法醫科學、疾病研究[29]。Xie等[30]的團隊基于基因靶向技術CRISPR編輯的譜系特異性示蹤（CRISPR editing-based lineage-specific tracing，CREST）方法，在Cre小鼠中進行克隆示蹤，并使用基于CREST的兩種互補策略來繪制發育中的小鼠腹側中腦的單細胞譜系，之后通過應用snapshotting CREST構建了小鼠腹側中腦發育的時空譜系景觀，進一步創建了“panda CREST”（前體和衍生物相關的CREST），通過該方法確定了多源多巴胺能神經元的起源，并證明了一個以轉錄組定義的具有不同的克隆命運和分子特征的包括異質的前體的前體類型。DNA條形碼技術通過提供獨特的分子標簽來增強譜系示蹤的精度，而譜系示蹤技術可以在DNA條形碼標記的基礎上提供更詳細的細胞行為信息，二者結合可以提供關于細胞行為和命運的更全面和精確的理解，目前這一技術被廣泛用于再生細胞的追蹤，但是在肝再生領域的應用還有待進一步探索。
1.4 scRNA-seq技術
scRNA-seq技術是一種常見的分子生物學技術，它允許在單個細胞級別分析生物樣本中的基因表達情況，可以揭示細胞的分子特征，而譜系示蹤技術可以提供這些分子變化如何隨時間在細胞群體中傳播的動態信息，二者的組合對于理解復雜生物過程（如器官發育、疾病進程及腫瘤發生）至關重要。傳統的RNA測序技術通常是在整個細胞群體中進行，而scRNA-seq則允許深入了解每個細胞的基因表達模式，揭示不同細胞之間的差異和多樣性。scRNA-seq技術在器官再生研究中也取得了巨大的進步。相關研究[31]利用scRNA-seq技術來研究急性對乙酰氨基酚中毒后小鼠肝再生的動力學發現，位于再生前沿的肝細胞亞群在重編程到中心周圍狀態時會短暫上調胎兒特異性基因如甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和細胞黏附分子-17（cadherin-17，CDH17），其中內皮細胞、肝星狀細胞和巨噬細胞群體在免疫募集、增殖和基質重塑中有不同的參與；還有研究[32]通過scRNA-seq技術發現，多巴胺受體D2拮抗作用選擇性靶向巨噬細胞與結締組織生長因子、血管細胞黏附蛋白1及血管生態位之間的Yes相關蛋白依賴性纖維化串擾，促進嚙齒動物和大型動物模型中肝再生而不是纖維化。
2 譜系示蹤技術在肝再生中的應用
2.1 在鑒定肝再生細胞來源中的應用
肝細胞損傷后的再生細胞來源一直是研究的焦點。通過譜系示蹤技術揭示肝再生細胞為肝臟健康和治療肝臟疾病提供了新的希望。目前關于損傷后肝細胞的來源存在部分爭議。與存在干細胞或祖細胞的皮膚組織和腸上皮組織不同，肝再生過程中是否存在肝祖細胞尚無共識[33]。20世紀50年代中期，在利用對乙酰氨基熒光治療的大鼠中發現了位于膽管末端分支的Hering管中出現的橢圓形細胞，隨后的研究中將這種橢圓形細胞描述為增生上皮細胞，其特點為細胞體積小、核/漿比高，并且表達肝細胞標志物AFP，橢圓形細胞在體外表現出向肝細胞和膽管細胞分化的能力，因此被認為是雙向分化祖細胞[34]，該細胞也被報道為人類慢性肝臟疾病的肝祖細胞，其數量與疾病嚴重程度相關。然而由于缺乏針對橢圓形細胞的特異性標志物以及2-乙酰氨基芴/部分肝切除模型在小鼠中的不適用性，迄今為止，在任何經典小鼠損傷模型中仍缺乏直接的體內證據表明橢圓形細胞能夠產生成熟的肝細胞和膽管細胞。
近年來通過體外培養、肝再生試驗和譜系示蹤研究了肝祖細胞[35-37]。在AhCre+Mdm2flox/flox小鼠模型中使用肝細胞譜系追蹤檢測到肝祖細胞的激活，在肝細胞廣泛受損時，上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）＋CD24＋CD133＋肝祖細胞移植可恢復AhCre+Mdm2flox/flox小鼠受損的肝臟[38]。此外，Aizarani等[39]通過scRNA-seq和類器官培養，在人肝臟中鑒定出EpCAM＋TROP2intCK19low祖細胞，具有較強的類器官形成能力。
盡管通過體外培養和細胞移植已經確定了這些肝細胞亞群的功能，但它們在體內穩態和肝損傷下的功能仍有待確定，需要通過結合空間轉錄組和scRNA-seq或通過譜系追蹤研究來進一步表現這些細胞亞群。Furuyama等[40]應用譜系追蹤方法發現，膽管細胞特異基因Sox9IRES-CreERT2敲入小鼠細胞系中，在穩態和四氯化碳、膽總管結扎或酒精乙二酰鹽、亞硝胺、巴石松、髓樣組織破碎物飲食誘導的肝損傷下，表達Sox9的細胞對肝再生有顯著影響；而Tarlow等[41]則發現，在使用BAC轉基因Sox9-CreERT2小鼠中肝細胞極少來自Sox9+細胞。Qin等[42]通過研究Sox9敲除小鼠發現，Sox9作為一種重要的轉錄因子，直接與小型異二聚體伴侶啟動子結合以調節其轉錄，此外，Sox9通過抑制小型異二聚體伴侶信號傳導和改善線粒體功能來改善急性肝損傷的機制。以上這些研究之間的差異可能是由于Sox9基因標記小鼠工具中啟動子的特異性和敏感性差異。盡管肝祖細胞的存在仍存在爭議，但這些細胞亞群的研究為肝再生的機制提供了新的線索。未來的研究將繼續關注這些潛在的再生細胞來源，以期更全面地了解肝再生過程，從而為肝臟疾病的治療具有潛在的可能性。
2.2 在肝再生區域鑒定中的應用
肝細胞約占肝臟總細胞數的70%，在生理條件下以緩慢的速度進行自我更新。肝細胞高度多樣化，具有不同的功能和代謝表達特征，沿著門-中央軸存在不同的代謝分區[43]。根據肝細胞的代謝特征大致可分為3個區域（這些區域被稱為代謝分區），鄰近門靜脈的肝細胞被稱為第一區，可接觸到由肝動脈和門靜脈分別輸送的高濃度氧和營養物質的血液；靠近中央靜脈的肝細胞屬于第三區，在這里進行糖酵解、谷氨酰胺合成和異物代謝；第二區位于上述兩個區域之間[44]。
scRNA-seq結合空間重建對肝臟基因的表達模式和細胞群分區提供了可靠的研究依據。通過標記肝細胞亞群進行的譜系示蹤研究揭示了它們在穩態和肝再生期間在肝小葉中的特定分布，如Mfsd2a+肝細胞和混合型肝細胞位于第一區，而Axin2+肝細胞主要位于第三區，端粒體酶高表達（high telomerase expression，TERThigh）肝細胞散布于肝小葉中。
在穩態下，肝細胞自我復制有助于維持肝功能和質量[45]。Lgr5+/Axin2+肝細胞在許多組織中被認為是利用Wnt/β-catenin信號通路來維持其高增殖能力的組織干細胞[46]。相關研究[47]表明，在Wnt敲除的肝細胞中觀察到了肝細胞再生受損，還發現表達Wnt2和Wnt9b的內皮細胞缺失導致3區β-catenin靶標的丟失，從而破壞了肝臟分區過程中的動態性；同時肝細胞在中央門區呈現出Wnt/β-catenin信號梯度，在這個梯度中Lgr5和Axin2在中央門區肝細胞中共同表達[48]。Wang等[49]使用在內源性Axin2基因啟動子控制下表達Cre-ERT2的Axin2－ Cre-ERT2小鼠證明Axin2+ 肝細胞是一個自我更新的細胞群，它們在穩態期間的1年內擴展到整個肝臟面積的30%，以取代其他肝細胞亞群；然而另一項研究[50]使用細菌人工染色體轉基因小鼠來追蹤Axin2+細胞，顯示門區Axin2+肝細胞在增殖能力上與其他肝細胞亞群沒有顯著差異。
有研究發現，在慢性門區肝損傷中，混合型肝細胞和Mfsd2a+肝細胞受到嚴重影響，而中央小葉和中央門區肝細胞，特別是TERThigh肝細胞，有助于肝細胞再生。如Font-Burgada等[51]研究了門區肝細胞的貢獻，鑒定出一種混合型門區肝細胞亞群，這些亞群細胞同時表達成熟肝細胞標志物肝細胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）4α和低水平的膽管細胞特異基因Sox9，盡管混合型肝細胞在損傷后對肝細胞再生有貢獻，但在生理條件下混合型肝細胞的比例仍保持在約4.5%左右；此外，另一種門區亞群Mfsd2a+肝細胞的比例從6周時的40%下降到20周時的20%，然后在穩態下保持穩定[52]。在慢性中央門區損傷中，TERThigh、混合型肝細胞和Mfsd2a+肝細胞顯著增殖和擴張，以重新填充肝臟，如有研究者[53]發現TERThigh肝細胞亞群在肝小葉中隨機分布，在穩態期間經歷了10倍的擴增，提示門區肝細胞在穩態期間發揮有限作用。此外，有研究者在2個獨立的研究小組利用多種遺傳譜系示蹤方法徹底探究了3個區域的肝細胞的增殖能力，如He等[54]開發了一個雙重重組酶介導的遺傳系統，包括DreER、Ki67-CrexER和R26-GFP報告基因，用于在給定時間窗口內連續記錄細胞增殖，發現第二區的肝細胞比第三區和第一區的肝細胞具有更高的增殖率；Wei等[55]在14個 CreER基因敲入小鼠模型中進行了譜系示蹤，標記了不同區域的肝細胞亞群，并發現第2區的肝細胞是維持穩態再生和修復的主要貢獻者。這些研究進一步證明了在穩態下，肝細胞在不同區域具有不同的增殖能力，肝細胞的自我復制對于維持肝功能和質量至關重要，尤其是中央小葉肝細胞對穩態再生的貢獻最大，這對于深入了解肝功能的維持和修復過程具有重要意義。
2.3 在研究肝損傷后再生機制中的應用
肝損傷根據發生的時間分為急性和慢性損傷，而不同類型的損傷導致的再生途徑也不同[56]。肝再生是通過不同肝細胞增殖而來。在一項研究[50]中通過譜系示蹤技術發現，二倍體的Axin2周圍肝細胞負責維持肝臟穩態更新，整個肝臟中正在增殖的肝細胞不僅是Axin2周圍肝細胞，此結果提示，肝細胞的增殖能力廣泛分布，而不僅局限于罕見的干細胞樣群體[57]。此外，有研究[58]在由肝切除術和各類疾病導致的黃疸等引起的急性肝損傷中發現，肝再生是通過肝細胞增殖完成。通過scRNA-seq技術研究了急性對乙酰氨基酚中毒后小鼠肝再生的動態過程發現，肝細胞在整個肝小葉中增殖，并且產生快速重新填充壞死中心周區所需的有絲分裂壓力，位于再生前沿的肝細胞亞群在重編程到中心周狀態時會短暫上調胎兒特異性基因，包括AFP和CDH17，同時發現肝臟內的其他細胞在免疫募集、增殖和基質重塑中分別發揮各自的作用[31]。最近Wen等[59]對使用Cre-loxp酶系統處理的小鼠進行肝切除術后發現，白介素-33可通過腸-肝軸釋放五羥色胺促進肝再生。此外Lin等[60]采用譜系追蹤對正在分裂的肝細胞進行成像，以估計再生過程中有絲分裂錯誤的頻率，排除了來自非肝細胞來源的再生，發現多倍體肝細胞在慢性損傷期間能夠保持再生肝組織的能力而不產生有絲分裂錯誤，并且在肝硬化的肝臟中通常觀察不到非整倍體，增加多倍體肝細胞數量可增加肝再生能力。結合Matsumoto等[61]使用四色熒光譜系示蹤技術結合流式細胞分選技術的研究，發現多倍體肝細胞在原位具有廣泛的再生能力，并在再生響應期間經常經歷還原有絲分裂，同時在肝損傷修復過程中多倍體肝細胞可以增殖，而一些肝細胞則表現出減少的二倍體狀態。早期的研究發現，肝損傷將導致HNF1同源框β（HNF1 homeobox β，HNF1β）對于肝祖細胞的增殖和肝細胞的再生，尤其是慢性肝損傷后。Rodrigo-Torres等[62]通過誘導小鼠產生急性或慢性肝損傷并使用攜帶黃色熒光蛋白基因小鼠追蹤HNF1β+ 膽管細胞的譜系發現，HNF1β+ 膽管細胞是肝祖細胞的起源，肝損傷后可分化為有助于肝再生的肝細胞。肝祖細胞通常是靜態的，在肝損傷發生時它被激活并分化為肝細胞和膽管上皮細胞，以支持肝再生和維持肝功能[63]。此外，Choi等[64]通過使用Cre-loxp酶系統處理的熒光斑馬魚來跟蹤肝細胞的譜系，發現膽管上皮細胞可轉分化并增殖為肝細胞，從而促進了肝再生。Pu等[65]通過雙遺傳譜系追蹤方法鑒定并特異性標記了一種起源于膽管上皮細胞的過渡性肝祖細胞，可在嚴重肝損傷再生過程中分化為肝細胞，發現通過Notch和Wnt/β-catenin信號轉導分別協調了膽管上皮細胞到過渡性肝祖細胞和過渡性肝祖細胞到肝細胞的轉換，此研究為轉分化輔助肝再生提供了功能和機制見解。這些研究結果提示，肝組織修復和再生功能可受到多種器官及組織調控，不僅局限于肝內，同時這一修復與再生過程也不單一局限于干細胞群體，成熟的肝細胞和膽管上皮細胞也表現出一定的再生潛力。
病毒感染作為一種常見的慢性肝損傷，是全球肝癌的主要原因，其中乙型肝炎病毒感染是最常見的致病因子之一。有研究者[66]利用譜系示蹤技術對人肝細胞癌生物樣本進行轉錄組測序發現，多聚腺苷酸結合蛋白3、缺氧誘導因子1α、核糖體蛋白 S6 激酶 A3等基因與乙型肝炎病毒的感染密切相關。同時譜系示蹤技術也被用于探索與乙型肝炎病毒感染相關的信號通路對疾病進展的影響[67]。早期研究發現，使用Cre-loxP系統特異性敲除Mdm2基因，可以導致肝細胞的凋亡和壞死，從而影響肝再生。通過對乙型肝炎病毒相關肝細胞癌的綜合蛋白質基因組學研究[68]分析發現，與細胞周期調控相關的Mdm2/p53通路發生變化，提示乙型肝炎病毒相關肝損傷與胰島素樣生長因子+、AFP+、EpCAM+ 這3類的肝祖細胞表型顯著相關，可能激活肝祖細胞增殖，從而介導肝損傷修復和肝再生。此外，有研究[69]顯示，受Ras/絲裂原活化蛋白激酶信號控制的絲氨酸反應因子（serum response factor，SRF）被用作譜系示蹤的靶標，在SRF-VP16小鼠中發展成了肝細胞癌，這也進一步表明Ras/絲裂原活化蛋白激酶信號通路在肝細胞癌中是高度致癌的通路。
總體而言，譜系示蹤技術為肝再生研究提供了有力的工具，更有助于全面且系統地了解肝損傷修復的機制，為相關疾病的治療和預防提供了新的見解和潛在的可能性。然而盡管已取得了重要的研究進展，但仍需進一步的研究來深入探討不同類型的肝損傷和再生機制的復雜性。
3 總結與展望
肝再生是一個復雜而重要的生理過程，對于維護身體的正常代謝和生理功能至關重要。譜系示蹤技術已在肝再生研究中取得了較大進展，為深入了解肝再生機制提供了強大的工具。研究人員通過譜系示蹤技術已揭示了肝臟中不同亞群肝細胞在穩態和損傷條件下的分布、再生過程和轉分化機制，具體來說，譜系示蹤技術已揭示了以下關鍵發現：① 肝臟中不同類型肝細胞在肝小葉內有特定的分布，譜系示蹤能幫助了解它們在肝臟結構中的位置和功能；② 肝細胞的再生主要通過代償性增殖來實現，譜系示蹤揭示了不同亞群肝細胞的再生潛力和貢獻；③ 在慢性肝損傷條件下，肝細胞和膽管細胞之間的轉分化現象已被證實，這一過程得到了譜系示蹤技術的支持；④ Wnt/β-catenin、Hippo/Yes相關蛋白和Notch信號通路在肝再生中扮演關鍵角色，譜系示蹤幫助了解這些信號通路的具體作用。
盡管譜系示蹤技術在肝再生研究中具有許多優勢，但也需認識到其局限性，包括：① 標志特異性的挑戰。譜系示蹤技術通常需使用特定的標志物或遺傳編輯方法來標記目標細胞群體，然而在肝再生中，不同類型的細胞可能具有相似的表型或表面標志，這可能導致標志特異性不足，使得難以準確追蹤特定的細胞群體。② 時間和成本。進行譜系示蹤實驗通常需大量的時間和資源，需要培養和維護動物模型或細胞系進行標記和監測，以及進行數據分析，這可能會導致研究周期較長且成本較高。③ 動物模型的限制。在研究肝再生時，通常需使用動物模型如小鼠，然而小鼠和人類之間存在生物學差異，因此研究結果在轉化到人類臨床應用時可能存在局限性。④ 無法解決所有問題。譜系示蹤技術主要用于追蹤細胞的命運和分化，但它不能解決所有關于肝再生機制的問題，其他技術如scRNA-seq和功能實驗也需結合使用，以全面理解肝再生的復雜過程。⑤ 倫理和法律問題。使用動物模型進行研究可能引發倫理和法律問題，特別是在涉及基因編輯或干細胞治療等高風險技術時。盡管如此，隨著譜系示蹤技術的不斷進步，仍可期待更深入、更全面的研究，以揭示肝再生機制的更多細節，這將有助于開發新的治療策略，改善肝臟疾病的治療效果，并為器官再生研究領域提供更多有關細胞命運和分化的見解。譜系示蹤技術將繼續在肝再生研究中發揮重要作用，為未來的醫學和生物學研究提出更多機會和挑戰。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：周林巖負責文獻檢索、撰寫論文與修改；李鑒、李勇男和蔣祥彥參與稿件修改及定稿；焦作義參與論文選題和設計并給予指導。
