胰腺癌中95%以上為胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC），其惡性程度高，診斷和治療難度極大，多數病例在晚期確診，預計到2025年，它對整體癌癥死亡率的影響將會加大[1-2]。手術是PDAC的唯一根治性治療方法，然而約90%的患者在術后7～9個月內復發，5年總生存率僅為8%～10%[3]。術后輔助化療雖能延緩疾病復發，但近80%的患者仍在化療后14個月左右復發，5年總生存率低于30%[4]。藥物治療（生物制劑和靶向）效果也不顯著，因為PDAC對這些藥物的耐藥性普遍存在，并且對免疫檢查點抑制劑幾乎完全不敏感，反應率低于5%[5]。其原因在于，胰腺癌耐藥性與其基因分型復雜、腫瘤內外的異質性以及免疫微環境的多樣性密切相關[6-7]，胰腺癌根據基因表達或免疫特征被分為多種亞型[8]，胰腺癌的腫瘤內異質性至少有3種遺傳異質性類型[9-10]，此外，對免疫檢查點抑制劑不敏感性部分源于PDAC的低突變率和新抗原的稀缺性。然而近年有研究[11]表明，多數PDAC攜帶的新抗原數量超出之前預測，而且通過對PDAC長期存活者的研究[12]顯示，遞送新抗原的策略可能誘導產生新抗原特異性T細胞，從而改善患者預后。由于胰腺癌的這些腫瘤特性，使它對傳統的單克隆抗體和小分子抑制劑治療產生耐藥性。而癌癥疫苗具有包括非特異性效應小、治療窗口寬、毒性低、可誘導持久的免疫記憶等[13]特點，使它可根據個體腫瘤的特征實現精準靶向，其中尤其是mRNA癌癥疫苗，其核心理念是引導免疫系統識別并攻擊特定的腫瘤相關抗原或新抗原[14]。通過使用mRNA編碼這些特異性抗原，旨在激發免疫反應，特異性地靶向并殺死癌細胞。目前治療用mRNA疫苗技術加速了個體化新抗原疫苗的快速生產與遞送，并通過新開發的臨床級制劑有效激活抗原呈遞細胞，使之融入了常規腫瘤學工作流程[15]。本綜述將從多個維度切入，首先回顧胰腺癌疫苗研究的總體現狀，接著深入探討mRNA疫苗的機制優勢，然后聚焦胰腺癌mRNA疫苗的創新開發策略及其應用情況，最終展望其未來發展前景。
1 常規胰腺癌疫苗
目前仍有多種常規疫苗類型包括細胞型、外泌體型、多肽型和DNA型正在研發中。
1.1 基于細胞的胰腺癌疫苗
目前可用的細胞型胰腺癌疫苗包括樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）型和腫瘤細胞型[16]。
有研究者[17-18]探討了DCs型疫苗WT1、SVN-2B等與放化療結合對胰腺癌患者療效的影響，發現這些疫苗均能激活免疫反應，但在生存受益方面未見明顯改善。最近一項單中心Ⅰ/Ⅱ期聯合試驗[19]顯示，DCs疫苗在接受外科手術后的胰腺癌患者中顯著提高了2年無復發生存率。然而，開發DCs疫苗需要自體細胞制備，制備過程非常費力且耗時且不經濟。
基于自體和異體腫瘤細胞的腫瘤細胞型疫苗均比較適合個體化治療。目前已有以異體腫瘤細胞為基礎的疫苗，如GVAX（分泌粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的異體胰腺癌疫苗）和Algenpantucel-L（超急性胰腺癌疫苗）用于胰腺癌治療。譬如Zheng等[20]報道了GVAX在可切除胰腺癌患者中應用發現，與環磷酰胺相比，GVAX未能提高轉移性PDAC患者的生存率；在一項多機構Ⅱ期臨床試驗[21]中發現，Algenpantucel-L聯合標準輔助化放療治療后胰腺癌患者的12個月總生存率和無病生存率分別達到86%和62%。然而分析文獻發現，腫瘤細胞型疫苗沒有考慮到胰腺癌的廣泛異質性，因此不適合個體化治療；此外，自體腫瘤細胞獲取可能并不充足，因為只有15%～20%的胰腺癌患者符合手術條件[22]；而且相關研究的證據仍不充分。
1.2 基于外泌體的胰腺癌疫苗
腫瘤源性外泌體是一種納米級脂質雙分子層包裹的囊泡，可將生物活性信息傳遞到腫瘤微環境中來促進腫瘤進展[23]。外泌體含有多種腫瘤抗原，促進DCs結合和吸收外泌體的特異性蛋白質。Xiao等[24]報道，與細胞毒性藥物相比，負載腫瘤源性外泌體疫苗的DCs可激活CD4+ T細胞并顯著延長小鼠的生存期。Zhou等[25在體內外實驗中發現，利用免疫原性死亡腫瘤細胞提取的外泌體遞送抗胰腺癌疫苗，不僅能延緩PDAC腫瘤生長，與化療藥物聯合還能顯著提升治療效果。此外，腫瘤源性外泌體還包括蛋白質和核酸，除了具有增強機體免疫力的強大潛力，還可能會在接種疫苗后通過破壞免疫平衡而引發自身免疫性疾病，從而對精準治療的安全性提出了挑戰[26]。
1.3 基于肽的胰腺癌疫苗
肽類疫苗是根據抗原表位（抗原的最小免疫原性區域）開發的[27]。KRAS靶向肽是第1個進行臨床試驗的基于肽的疫苗。Palmer等[28]的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗分析TG01（靶向KRAS突變的7肽疫苗）在胰腺癌中的治療效果，共納入了32例胰腺癌患者，其中30例合并KRAS突變，患者在R0（31%）或R1（69%）切除術后，接受皮下注射TG01和重組人粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子，同時聯合吉西他濱化療，結果顯示，患者中位總生存期為33.3個月，中位無病生存期為16.1個月，療效較好。另一種常用的多肽疫苗是端粒酶靶向疫苗（GV1001）。在一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[29]中，該疫苗的耐受性良好，同時提高了患者的生存率。然而也有研究[30]表明，與單用吉西他濱相比，GV1001與吉西他濱聯合用藥并不能明顯改善晚期胰腺癌患者的總生存期。值得注意的是，腫瘤多肽疫苗受主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制，只能激活單克隆T細胞，這可能會降低抗腫瘤免疫反應的強度，從而無法滿足精準治療對效率的基本要求。
1.4 基于DNA的胰腺癌疫苗
用于癌癥免疫療法的DNA疫苗旨在傳遞一個或多個編碼腫瘤抗原的基因，從而激發或增強針對在腫瘤發生、發展和轉移過程中起核心作用抗原的抗原特異性免疫反應[31]。ENO1、MUC1、survivin和血管內皮生長因子受體-2靶向DNA疫苗是迄今為止探索基于DNA的胰腺癌疫苗的范例。在一項臨床前研究[32]中，ENO1 DNA疫苗有效地誘導了胰腺癌轉基因小鼠的效應T細胞浸潤、抗體形成和腫瘤細胞毒性。以MUC1為靶標的DNA疫苗可誘導強烈的特異性細胞毒性T淋巴細胞反應，對小鼠具有治療和預防作用[33]。survivin DNA疫苗可誘導特異性抗腫瘤免疫并延長小鼠的存活時間[34]。一項Ⅰ期臨床實驗[35]中，與安慰劑治療相比，接種編碼血管內皮生長因子受體-2的表達質粒的VXM01型疫苗是安全的，具有免疫原性，并能提高疫苗特異性T細胞反應。值得注意的是，DNA疫苗具有改變宿主基因組的高風險，而且編碼抗原的長期表達和抗DNA自身抗體的產生可能會限制其應用[36]。
總之，這些常規疫苗在胰腺癌治療方面雖然取得了一定進展，但仍存在諸多局限。DCs疫苗的制備過程費時且成本高，自體腫瘤細胞疫苗受限于手術條件，而異體腫瘤細胞疫苗的效果因癌癥的廣泛異質性而大打折扣。基于外泌體的胰腺癌疫苗雖然顯著增強了治療效果，但卻可能引發自身免疫性疾病。基于肽的疫苗如KRAS靶向肽和端粒酶靶向疫苗雖然能激活T細胞，但在MHC限制下的抗腫瘤免疫反應強度仍顯不足。基于DNA的疫苗存在改變宿主基因組的高風險，其長期表達和抗DNA自身抗體的產生也限制了其應用前景。由此可見，目前的疫苗并非胰腺癌精準治療的最佳選擇。因此，迫切需要開發一種新型疫苗，以滿足胰腺癌患者的個性化治療需求。
2 mRNA疫苗在癌癥精準治療中的優越性
早期有研究[37]已經證明，mRNA可以誘導細胞免疫和體液免疫。隨后曾因mRNA不穩定性、體內遞送效率低以及潛在的先天免疫原性問題而限制了其開發。mRNA修飾和傳遞技術的進步在很大程度上解決了這些問題，如修飾核苷的應用可以防止模式識別受體識別mRNA，從而提高翻譯效率[38]；載體如脂質納米顆粒、多聚體和聚合物納米顆粒的應用促進了mRNA的體內傳遞[39]。除了根據腫瘤的基因表達譜編碼個體化蛋白以克服腫瘤的異質性外，與常規疫苗相比，mRNA疫苗還能滿足精準治療的要求，突出表現為精確靶向、高效、安全和經濟成本，使它正在成為癌癥精準治療的有效候選方案。
2.1 精確靶向是個體化治療的關鍵
mRNA可作為蛋白質翻譯的模板，并利用宿主細胞中的機制生產疫苗，這一特性允許對蛋白質產物進行翻譯后修飾，包括適當折疊來有效發揮作用[40]；此外，它還可用于生產在生物反應器無法正確折疊和組裝的多聚蛋白。mRNA疫苗可用于生成具有內源性特性的蛋白質產物來確保精確靶向。Sahin等[15]開發的mRNA個體化突變組疫苗，成功激發了對多種癌癥突變的強大免疫反應，在2例黑色素瘤患者接種后顯示了T細胞浸潤和特異性腫瘤細胞殺傷效果，5例轉移性疾病患者中有2例出現明顯疫苗客觀反應，其中1例在結合程序性死亡蛋白1阻斷療法后達到完全緩解。此初步研究結果展示了mRNA疫苗在精確靶向中的效果。
2.2 高效是精準治療的另一個關鍵點
mRNA疫苗可同時編碼多種抗原，從而大大提高其腫瘤靶向功效。符合這一要求的mRNA疫苗能夠誘導先天性免疫和適應性免疫，從而發揮高效的抗腫瘤作用。例如，DCs能通過模式識別受體吞噬外源mRNA，激活一系列促炎癥相關的信號通路，從而增強先天免疫功能。在刺激適應性免疫方面，外源mRNA編碼的蛋白質會通過降解為肽，隨后被轉運到內質網，加載到MHC-Ⅰ分子上，運輸到細胞表面，并最終呈遞給并激活CD8+ T細胞[41]。
2.3 安全性對于精準治療也至關重要
mRNA不會整合到宿主基因組序列中，因此不存在插入突變的風險；同時，mRNA的生產不涉及有毒化學物質，也不會有細胞培養過程病毒污染的風險；此外，mRNA可被RNA酶快速降解，其半衰期是可調控的，這確保了mRNA編碼蛋白質表達是可控的[42]。最顯著的例子是mRNA新冠疫苗BNT162b2和mRNA1273，它們都在臨床試驗中表現出高安全性和良好的耐受性[43-44]。
2.4 經濟性是精準治療的重要原則
mRNA可以通過使用DNA模板、三磷酸核糖核苷酸和重組酶在體外生產，這大大縮短了生產時間，并可以實現批量生產，從而降低生產成本。mRNA疫苗的生產過程只需約10 d，比其他類型的疫苗生產周期短[45]，這種快速生產能力意味著在腫瘤診斷后的短時間內即可開始治療。從工業角度來看，約1 μg的DNA模板可以生成數百μg的mRNA。實際上，僅需約10 g的mRNA就能生產出高達10萬劑的疫苗。 mRNA疫苗的生產既方便又經濟，符合精準治療的經濟原則。
3 胰腺癌mRNA疫苗的研制策略
mRNA疫苗因其精確靶向、高效、安全和經濟方便而有望提供個體化的胰腺癌治療。越來越多的證據表明，個體化胰腺癌mRNA疫苗的開發過程可分為3個關鍵模塊，包括腫瘤抗原識別、區分免疫亞型和mRNA疫苗構建。
3.1 腫瘤抗原識別
mRNA疫苗的核心理念是引導免疫系統識別并攻擊特定的腫瘤相關抗原或新抗原[14]。腫瘤相關抗原是癌細胞中高水平表達的蛋白質，而新抗原是癌細胞突變后產生的全新蛋白質。理想的候選疫苗應具備以下特征：腫瘤細胞特有、參與腫瘤發生和發展、不被免疫系統耐受、對抗腫瘤免疫有刺激作用[46]。因此，抗原選擇是開發疫苗的第一步。目前癌癥免疫治療的靶點包括腫瘤相關抗原、腫瘤特異性抗原及MHC-Ⅱ-肽。
3.1.1 腫瘤相關抗原
腫瘤相關抗原是一種在正常組織中表達但在腫瘤組織中過度表達的抗原，它具有腫瘤特異性弱、中樞免疫耐受性強、免疫原性弱等特點。盡管腫瘤相關抗原有很多缺點，但其廣譜性使它對低腫瘤突變負荷的患者可能更為適合。編碼腫瘤相關抗原的mRNA癌癥疫苗通過針對癌細胞表面相對于正常細胞過度表達的抗原，誘導特異性免疫反應，這一過程包括確定患者腫瘤細胞表達的腫瘤相關抗原并設計編碼這些抗原的mRNA序列；隨后mRNA被遞送入免疫細胞，翻譯并加工成MHC-Ⅰ/Ⅱ類復合物，然后呈現在這些細胞表面，這種表現會觸發特異性針對表達這些抗原細胞的免疫反應。如今使用多種腫瘤相關抗原組合開發mRNA疫苗已成為一種趨勢。2009年Weide等[47]使用編碼黑色素瘤6種腫瘤相關抗原的mRNA疫苗，并以粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子為佐劑，對21例黑色素瘤患者進行了Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，結果表明，疫苗能顯著減少免疫抑制細胞（Foxp3+/CD4+ T細胞）的數量且無不良反應。近年推出的CV8102 mRNA疫苗，在臨床前測試中展現了較好的抗腫瘤效果。目前，這款疫苗已進入臨床試驗階段，為包括胰腺癌在內的抗癌治療帶來了新曙光[48]。
3.1.2 腫瘤特異性抗原
與腫瘤相關抗原不同，腫瘤特異性抗原只在腫瘤細胞中表達，具有很強的免疫原性、高度的個體性和表位多樣性，因此是個體化疫苗的理想靶點。設計個體化的抗胰腺癌mRNA疫苗首先要通過比較腫瘤和配對正常組織的新一代測序數據來識別出腫瘤特異性非同義突變[49]，然后應用計算新抗原預測管道的相關方法來驗證突變基因的表達，并預測突變基因產生的肽與MHC等位基因的結合親和力[50]。高表達轉錄本與T細胞反應的增強相關，可彌補突變MHC的低結合親和力。此外，單一的MHCⅠ結合型腫瘤特異性抗原是不夠的，還需要額外的MHCⅡ結合型腫瘤特異性抗原才能產生真正有效的抗腫瘤免疫力[51]。MHCⅡ蛋白與抗原肽之間的結合是T細胞識別非自身抗原或腫瘤相關抗原，從而啟動體液免疫和細胞免疫的關鍵步驟。
3.1.3 MHCⅡ-肽的鑒定
由于MHCⅡ上的每個基因座（即人類白細胞DR抗原、DP抗原和DQ抗原）有多種不同的等位基因，使得MHCⅡ基因具有高度多態性，這使得其與肽的結合預測變得更加復雜。為了大規模掃描識別新抗原、開發腫瘤疫苗和設計藥物，研究者們開發了許多計算方法來促進MHCⅡ-肽的鑒定。預測MHC-肽結合可能性的計算方法一般有3種：評分函數、基于機器學習的方法和共識方法[52]。近年來，基于大量MHC ligand和結合數據的預測方法，如NetMHCⅡpan-4.1[53]和MixMHC2pred[54]，已經達到了非常高的預測精度，受試者操作特征曲線下面積已超過0.9。盡管這些算法能夠預測MHC-肽的結合，但它們還不能區分復合物半衰期（即動力學穩定性）的實驗差異。由于目前大多數疫苗中只有一小部分肽能引起CD8+ T細胞反應，因此提高新抗原肽-MHC的實際穩定性非常重要。穩定性預測工具NetMHCstabpan 在識別免疫原性突變方面表現出色，由Fasoulis等[55]開發的TLStab和TLImm模型分別在不同的穩定性和免疫原性測試集上表現出相當或更好的性能。
隨著計算生物學的不斷發展，通過篩選過表達和突變基因以及預后和APC相關候選基因來識別腫瘤抗原的途徑已經成熟。值得注意的是，目前還沒有制定出能權衡以上每個特征的具體方法來為mRNA疫苗的開發篩選出最佳候選基因，但計算生物學的進展會讓我們建立起一種準確、靈敏的方法來確定胰腺癌的有效候選基因，從而開發出個性化的mRNA疫苗。
3.2 區分免疫亞型
腫瘤的免疫療法為各種實體瘤的治療帶來了革命性的變化。然而目前的免疫療法包括癌癥疫苗、溶瘤病毒療法、免疫檢查點導向免疫療法等，在提高PDAC患者生存率方面成效有限。
PDAC對免疫療法的免疫耐受可歸因于其復雜的免疫抑制微環境、低突變負荷、T細胞浸潤差等特點[56]。免疫治療后腫瘤的后續結果是進展還是消退，在很大程度上取決于腫瘤內的免疫環境，這種環境由各種細胞類型組成，如適應性免疫細胞、巨噬細胞、DCs、自然殺傷細胞和其他先天性免疫細胞。PDAC對新的免疫療法有很強的抵抗力，這是因為不同的免疫細胞之間相互協作，形成了一種高度免疫抑制的環境，這種環境有助于腫瘤的發展。目前有研究[57]指出，每例PDAC患者都存在復雜的腫瘤免疫微環境，這也是開發mRNA疫苗和選擇合適的疫苗接種患者所需的理論依據。免疫分型可用于反映腫瘤及其微環境的免疫狀態，同時也是選擇合適的免疫聯合療法的準確生物標志物，通過不同的免疫分型能幫助確定適合接種疫苗的患者[58]。
至今研究者們已根據不同的參數、方法和觀點確定了多種胰腺癌亞型。多種免疫學因素，包括免疫相關基因表達譜、免疫細胞組成等，均被用于胰腺癌免疫亞型的分組。Moffitt等[59]根據基因表達譜確定了兩種基質亞型（正常和活化）和兩種腫瘤亞型（基底樣和經典）。最近的有關胰腺癌的免疫分型是由Xing等[57]在2021年發布，在其研究中，通過分析ICGC數據庫中PDAC樣本的免疫相關基因表達譜，確定了5個免疫亞型，分別命名為IS1～IS5，其中IS1和IS2表現出免疫激活表型，即免疫學“熱”表型，與其他亞型相比生存率更高；IS4和IS5腫瘤是免疫學“冷”表型，與較高的腫瘤突變負荷相關；具有或不具有免疫抑制微環境的免疫性“冷”腫瘤的IS4和IS5腫瘤患者可能是mRNA疫苗的合適候選者；研究還發現，免疫細胞死亡調節劑、免疫檢查點、CA125和CA19-9在5種免疫亞型中的表達也存在差異，因此指出，IS1～IS5的免疫分型在預測腫瘤突變負荷和體細胞突變率以及作為預測PDAC免疫治療預后的生物標志物方面有很大的前景。
腫瘤組織中T細胞和其他免疫細胞的浸潤和活化以及免疫抑制細胞的抑制作用，在很大程度上決定了mRNA疫苗對具有特定免疫亞型的癌癥患者的治療潛力。雖然mRNA疫苗可以激活并促進T細胞向腫瘤浸潤，但這些細胞的進入在很大程度上仍會受到胰腺癌細胞脫膜間質的干擾[60]。因此，胰腺癌治療亟需mRNA疫苗與其他療法（而非單一疫苗）相結合，以及用于預測聯合療法治療反應的生物標志物。免疫原性化療和基質調節可通過改善免疫“冷”腫瘤的免疫原性和T細胞浸潤來增強mRNA疫苗的有效性[61]。此外，mRNA疫苗與免疫檢查點抑制劑相結合可改善免疫“熱”腫瘤的T細胞浸潤和功能[62]。mRNA疫苗與免疫檢查點抑制劑、過繼細胞療法、溶瘤病毒治療等其他免疫治療方法以及化療等傳統治療方式的聯合使用是目前研究的熱點。因此，免疫亞型有潛力作為預測聯合治療效果的準確生物標志物。總之，在免疫亞型、匹配的生物標志物和治療方法的指導下，聯合療法可提高mRNA疫苗治療胰腺癌的療效。
3.3 mRNA疫苗構建
mRNA疫苗中的mRNA是通過體外轉錄產生的，體外轉錄已成為設計和制備mRNA的常用技術，它以線性DNA為模板，在噬菌體RNA聚合酶的輔助下制備mRNA。在實際應用mRNA癌癥疫苗之前，必須解決幾個關鍵問題：包括遞送、穩定性、翻譯和免疫原性[41,63-64]。
3.3.1 遞送
由于裸mRNA的大小、降解性、電荷等原因，除了未成熟的DCs可以通過噬菌體吞噬途徑有效攝取mRNA外，裸mRNA無法有效穿過細胞膜進入細胞質[41]。為了更有效地將mRNA遞送到抗原呈遞細胞，必須適當選擇和優化mRNA制劑和給藥途徑。① 制劑。脂質納米顆粒作為mRNA遞送系統在臨床試驗中被廣泛研究[65]。新冠疫苗BNT162b2和mRNA1273均采用脂質納米顆粒形式[43,44]。相比于陽離子脂質，脂質納米顆粒代表的可電離脂質能在不同情況下攜帶不同的電荷，在制備過程的酸性緩沖液中帶正電，這有利于mRNA的封裝；而在生理條件下它們會變成中性，從而降低體內毒性并延長循環半衰期[66]。同樣，擁有自適應活性的脂質納米顆粒還是一種多功能佐劑，可提高傳統和下一代疫苗平臺的功效[67]。最近，為了更好地遞送mRNA，研究人員還測試了聚合物基納米顆粒[68]、脂質-聚合物混合納米顆粒[44]、無機納米載體[69]和細胞外囊泡[70]。聚合物基納米顆粒和無機納米載體的特點是具有超強的穩定性，而DCs和細胞外囊泡則具有顯著的免疫調節能力和生物相容性[71,72]。② 給藥途徑。mRNA遞送過程中任何一個環節出現問題都會影響療效。給藥途徑作為mRNA癌癥疫苗臨床應用的重要因素之一，對靶蛋白的翻譯效率和疫苗在體內的分布都具有很大影響[73]。目前已獲得批準的SARS-CoV-2 mRNA疫苗采用的是肌肉注射，但對于mRNA疫苗的最佳給藥途徑尚未達成共識。mRNA癌癥疫苗的每種給藥途徑包括肌肉注射、皮下注射、結節內注射、皮內注射和鼻內注射，都有其獨特的優點和局限性，目前其最佳給藥途徑仍在被不斷探討[74]。
3.3.2 穩定性
在成功遞送mRNA后，還必須適當調節mRNA在體內轉錄的半衰期，因為有多種因素會影響基于mRNA療法的藥效學和藥代動力學。體外合成的mRNA極不穩定，進入人體后容易失活。通過對mRNA的修飾可以提高蛋白質合成的速度和mRNA的功能半衰期。其中包括優化多聚（A）尾、密碼子、5′端帽、多聚-A尾、非翻譯區以及編碼蛋白質的開放閱讀框，以提高mRNA的穩定性[41]。
3.3.3 免疫原性
除了遞送和穩定性，還必須考慮免疫原性。免疫刺激不足會導致T細胞喪失和腫瘤耐受。不同于需要鋁鹽（明礬）、單磷酸脂質A或Toll樣受體激動劑等佐劑的肽或蛋白疫苗，mRNA可以被模式識別受體識別，而且它本身具有一定的免疫刺激功能，通過刺激先天性免疫來刺激干擾素-γ的產生，干擾素-γ是輔助性T淋巴細胞、趨化因子及其受體等炎癥因子的主要調節因子，它們之間相互作用來調節機體的免疫環境[75]。目前，干擾素-γ介導的先天免疫反應可以通過體外轉錄或高效液相色譜純化mRNA，以及優化序列和轉錄后純化來降低[76]。
3.3.4 翻譯
應避免激活雙鏈RNA識別的蛋白激酶，因為觸發這一信號通路會影響mRNA的翻譯。在體外轉錄過程中加入天然存在的修飾核苷，如2-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷或假尿苷，可阻礙雙鏈RNA的形成，從而抑制蛋白激酶R的激活[77]。
總之，mRNA疫苗構建策略的進步，在很大程度上提高了其治療胰腺癌的療效。
4 mRNA疫苗在胰腺癌治療中的應用情況
最近，由紀念斯隆凱特琳癌癥中心、BioNTech和基因泰克組成的研究小組在使用個性化mRNA癌癥疫苗治療PDAC的研究中取得了突破[7]，在Ⅰ期臨床試驗中，研究團隊為16例PDAC患者在手術切除后注射了表達多達20個新抗原的個性化mRNA疫苗——自體cevumeran，該疫苗通過靜脈注射使用脂質納米顆粒遞送，并與化療（mFOLFIRINOX方案）和免疫檢查點療法（抗PD-L1單克隆抗體）聯合使用，臨床試驗結果顯示，50%的受試者體內T細胞擴增反應顯著，證實了這種個性化mRNA疫苗能夠有效激發并增強免疫應答；經過中位18個月的隨訪，與對照組相比，獲得疫苗增強T細胞的患者中位無復發生存期明顯延長，該研究結果證實了個性化mRNA疫苗在PDAC治療中的有效性。此外，Zhang等[78]探討了PDAC的鐵死亡調控因子與免疫微環境和PD-L1的關系。研究發現，鐵死亡調控因子FANCD2在PDAC中上調，與總體生存、免疫微環境和藥物敏感性密切相關，為mRNA疫苗和個性化免疫治療提供了理論基礎，具有重要的臨床應用潛力。
5 結論與展望
要實現個性化胰腺癌疫苗的關鍵在于發現有效的腫瘤抗原、優化疫苗結構以及區分免疫亞型。盡管PDAC的突變率相對較低，mRNA疫苗仍能激發T細胞對PDAC特異的新抗原產生反應。因此，個性化mRNA疫苗是一種很有前景的胰腺癌治療策略。
值得注意的是，獲得足夠的腫瘤樣本是目前鑒定個性化腫瘤抗原和免疫亞型從而開發個性化mRNA疫苗的前提。由于癥狀隱匿和缺乏精準檢測手段，胰腺癌多數確診時已進展至晚期或轉移階段，僅15%～20%的患者可接受手術治療，導致腫瘤樣本主要依賴于活檢獲取[4]。然而胰腺腫瘤間及腫瘤內的異質性限制了活檢樣本的實際應用價值，不足以支持mRNA疫苗的個性化設計和構建，以及確定患者是否適合接受聯合治療。當前的解決方案是新輔助治療，它主要用于交界性可切除和局部晚期胰腺癌患者。對于交界性可切除胰腺癌，新輔助治療可以縮小腫瘤，提高手術成功率并簡化手術程序。而對于局部晚期胰腺癌，治療后的手術完全切除率為3%～79%[79]。通過新輔助治療縮小腫瘤，能提高手術成功率，并獲取充足的腫瘤樣本，這對于開發mRNA疫苗的腫瘤抗原和免疫亞型至關重要。
目前大多數癌癥mRNA疫苗是治療性的，而非預防性的。作為單一療法使用時，這些疫苗需要足夠的效力，且要多次給藥才能誘導抗腫瘤免疫反應。針對胰腺癌等具有高度免疫抑制和異質性腫瘤微環境的癌癥，治療性mRNA疫苗與其他免疫治療方法結合使用更可能成功。此外，開發預防性mRNA疫苗可能是應對這種棘手疾病的另一重要策略。預防性mRNA疫苗主要用于預防病毒感染，因為其抗原具有外生性，結構簡單，易于識別。然而，到目前為止，胰腺癌預防性疫苗的開發仍處于起步階段，主要原因在于胰腺癌發病的復雜性及疫苗接種效果難以評估。
隨著多組學的發展和交叉學科的融合進步，未來腫瘤特異性抗原的篩選將越來越精確。同時，不同癌癥類型或分期的患者也將得到合適的聯合治療，從而實現真正有效的個性化治療。此外，我們期望越來越多的預防性癌癥mRNA疫苗能夠問世，以真正實現癌癥的防患于未然。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：黃鴻才負責文獻查閱、文獻總結和文章撰寫；余華負責指導及文章審閱修改。
胰腺癌中95%以上為胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC），其惡性程度高，診斷和治療難度極大，多數病例在晚期確診，預計到2025年，它對整體癌癥死亡率的影響將會加大[1-2]。手術是PDAC的唯一根治性治療方法，然而約90%的患者在術后7～9個月內復發，5年總生存率僅為8%～10%[3]。術后輔助化療雖能延緩疾病復發，但近80%的患者仍在化療后14個月左右復發，5年總生存率低于30%[4]。藥物治療（生物制劑和靶向）效果也不顯著，因為PDAC對這些藥物的耐藥性普遍存在，并且對免疫檢查點抑制劑幾乎完全不敏感，反應率低于5%[5]。其原因在于，胰腺癌耐藥性與其基因分型復雜、腫瘤內外的異質性以及免疫微環境的多樣性密切相關[6-7]，胰腺癌根據基因表達或免疫特征被分為多種亞型[8]，胰腺癌的腫瘤內異質性至少有3種遺傳異質性類型[9-10]，此外，對免疫檢查點抑制劑不敏感性部分源于PDAC的低突變率和新抗原的稀缺性。然而近年有研究[11]表明，多數PDAC攜帶的新抗原數量超出之前預測，而且通過對PDAC長期存活者的研究[12]顯示，遞送新抗原的策略可能誘導產生新抗原特異性T細胞，從而改善患者預后。由于胰腺癌的這些腫瘤特性，使它對傳統的單克隆抗體和小分子抑制劑治療產生耐藥性。而癌癥疫苗具有包括非特異性效應小、治療窗口寬、毒性低、可誘導持久的免疫記憶等[13]特點，使它可根據個體腫瘤的特征實現精準靶向，其中尤其是mRNA癌癥疫苗，其核心理念是引導免疫系統識別并攻擊特定的腫瘤相關抗原或新抗原[14]。通過使用mRNA編碼這些特異性抗原，旨在激發免疫反應，特異性地靶向并殺死癌細胞。目前治療用mRNA疫苗技術加速了個體化新抗原疫苗的快速生產與遞送，并通過新開發的臨床級制劑有效激活抗原呈遞細胞，使之融入了常規腫瘤學工作流程[15]。本綜述將從多個維度切入，首先回顧胰腺癌疫苗研究的總體現狀，接著深入探討mRNA疫苗的機制優勢，然后聚焦胰腺癌mRNA疫苗的創新開發策略及其應用情況，最終展望其未來發展前景。
1 常規胰腺癌疫苗
目前仍有多種常規疫苗類型包括細胞型、外泌體型、多肽型和DNA型正在研發中。
1.1 基于細胞的胰腺癌疫苗
目前可用的細胞型胰腺癌疫苗包括樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）型和腫瘤細胞型[16]。
有研究者[17-18]探討了DCs型疫苗WT1、SVN-2B等與放化療結合對胰腺癌患者療效的影響，發現這些疫苗均能激活免疫反應，但在生存受益方面未見明顯改善。最近一項單中心Ⅰ/Ⅱ期聯合試驗[19]顯示，DCs疫苗在接受外科手術后的胰腺癌患者中顯著提高了2年無復發生存率。然而，開發DCs疫苗需要自體細胞制備，制備過程非常費力且耗時且不經濟。
基于自體和異體腫瘤細胞的腫瘤細胞型疫苗均比較適合個體化治療。目前已有以異體腫瘤細胞為基礎的疫苗，如GVAX（分泌粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的異體胰腺癌疫苗）和Algenpantucel-L（超急性胰腺癌疫苗）用于胰腺癌治療。譬如Zheng等[20]報道了GVAX在可切除胰腺癌患者中應用發現，與環磷酰胺相比，GVAX未能提高轉移性PDAC患者的生存率；在一項多機構Ⅱ期臨床試驗[21]中發現，Algenpantucel-L聯合標準輔助化放療治療后胰腺癌患者的12個月總生存率和無病生存率分別達到86%和62%。然而分析文獻發現，腫瘤細胞型疫苗沒有考慮到胰腺癌的廣泛異質性，因此不適合個體化治療；此外，自體腫瘤細胞獲取可能并不充足，因為只有15%～20%的胰腺癌患者符合手術條件[22]；而且相關研究的證據仍不充分。
1.2 基于外泌體的胰腺癌疫苗
腫瘤源性外泌體是一種納米級脂質雙分子層包裹的囊泡，可將生物活性信息傳遞到腫瘤微環境中來促進腫瘤進展[23]。外泌體含有多種腫瘤抗原，促進DCs結合和吸收外泌體的特異性蛋白質。Xiao等[24]報道，與細胞毒性藥物相比，負載腫瘤源性外泌體疫苗的DCs可激活CD4+ T細胞并顯著延長小鼠的生存期。Zhou等[25在體內外實驗中發現，利用免疫原性死亡腫瘤細胞提取的外泌體遞送抗胰腺癌疫苗，不僅能延緩PDAC腫瘤生長，與化療藥物聯合還能顯著提升治療效果。此外，腫瘤源性外泌體還包括蛋白質和核酸，除了具有增強機體免疫力的強大潛力，還可能會在接種疫苗后通過破壞免疫平衡而引發自身免疫性疾病，從而對精準治療的安全性提出了挑戰[26]。
1.3 基于肽的胰腺癌疫苗
肽類疫苗是根據抗原表位（抗原的最小免疫原性區域）開發的[27]。KRAS靶向肽是第1個進行臨床試驗的基于肽的疫苗。Palmer等[28]的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗分析TG01（靶向KRAS突變的7肽疫苗）在胰腺癌中的治療效果，共納入了32例胰腺癌患者，其中30例合并KRAS突變，患者在R0（31%）或R1（69%）切除術后，接受皮下注射TG01和重組人粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子，同時聯合吉西他濱化療，結果顯示，患者中位總生存期為33.3個月，中位無病生存期為16.1個月，療效較好。另一種常用的多肽疫苗是端粒酶靶向疫苗（GV1001）。在一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[29]中，該疫苗的耐受性良好，同時提高了患者的生存率。然而也有研究[30]表明，與單用吉西他濱相比，GV1001與吉西他濱聯合用藥并不能明顯改善晚期胰腺癌患者的總生存期。值得注意的是，腫瘤多肽疫苗受主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制，只能激活單克隆T細胞，這可能會降低抗腫瘤免疫反應的強度，從而無法滿足精準治療對效率的基本要求。
1.4 基于DNA的胰腺癌疫苗
用于癌癥免疫療法的DNA疫苗旨在傳遞一個或多個編碼腫瘤抗原的基因，從而激發或增強針對在腫瘤發生、發展和轉移過程中起核心作用抗原的抗原特異性免疫反應[31]。ENO1、MUC1、survivin和血管內皮生長因子受體-2靶向DNA疫苗是迄今為止探索基于DNA的胰腺癌疫苗的范例。在一項臨床前研究[32]中，ENO1 DNA疫苗有效地誘導了胰腺癌轉基因小鼠的效應T細胞浸潤、抗體形成和腫瘤細胞毒性。以MUC1為靶標的DNA疫苗可誘導強烈的特異性細胞毒性T淋巴細胞反應，對小鼠具有治療和預防作用[33]。survivin DNA疫苗可誘導特異性抗腫瘤免疫并延長小鼠的存活時間[34]。一項Ⅰ期臨床實驗[35]中，與安慰劑治療相比，接種編碼血管內皮生長因子受體-2的表達質粒的VXM01型疫苗是安全的，具有免疫原性，并能提高疫苗特異性T細胞反應。值得注意的是，DNA疫苗具有改變宿主基因組的高風險，而且編碼抗原的長期表達和抗DNA自身抗體的產生可能會限制其應用[36]。
總之，這些常規疫苗在胰腺癌治療方面雖然取得了一定進展，但仍存在諸多局限。DCs疫苗的制備過程費時且成本高，自體腫瘤細胞疫苗受限于手術條件，而異體腫瘤細胞疫苗的效果因癌癥的廣泛異質性而大打折扣。基于外泌體的胰腺癌疫苗雖然顯著增強了治療效果，但卻可能引發自身免疫性疾病。基于肽的疫苗如KRAS靶向肽和端粒酶靶向疫苗雖然能激活T細胞，但在MHC限制下的抗腫瘤免疫反應強度仍顯不足。基于DNA的疫苗存在改變宿主基因組的高風險，其長期表達和抗DNA自身抗體的產生也限制了其應用前景。由此可見，目前的疫苗并非胰腺癌精準治療的最佳選擇。因此，迫切需要開發一種新型疫苗，以滿足胰腺癌患者的個性化治療需求。
2 mRNA疫苗在癌癥精準治療中的優越性
早期有研究[37]已經證明，mRNA可以誘導細胞免疫和體液免疫。隨后曾因mRNA不穩定性、體內遞送效率低以及潛在的先天免疫原性問題而限制了其開發。mRNA修飾和傳遞技術的進步在很大程度上解決了這些問題，如修飾核苷的應用可以防止模式識別受體識別mRNA，從而提高翻譯效率[38]；載體如脂質納米顆粒、多聚體和聚合物納米顆粒的應用促進了mRNA的體內傳遞[39]。除了根據腫瘤的基因表達譜編碼個體化蛋白以克服腫瘤的異質性外，與常規疫苗相比，mRNA疫苗還能滿足精準治療的要求，突出表現為精確靶向、高效、安全和經濟成本，使它正在成為癌癥精準治療的有效候選方案。
2.1 精確靶向是個體化治療的關鍵
mRNA可作為蛋白質翻譯的模板，并利用宿主細胞中的機制生產疫苗，這一特性允許對蛋白質產物進行翻譯后修飾，包括適當折疊來有效發揮作用[40]；此外，它還可用于生產在生物反應器無法正確折疊和組裝的多聚蛋白。mRNA疫苗可用于生成具有內源性特性的蛋白質產物來確保精確靶向。Sahin等[15]開發的mRNA個體化突變組疫苗，成功激發了對多種癌癥突變的強大免疫反應，在2例黑色素瘤患者接種后顯示了T細胞浸潤和特異性腫瘤細胞殺傷效果，5例轉移性疾病患者中有2例出現明顯疫苗客觀反應，其中1例在結合程序性死亡蛋白1阻斷療法后達到完全緩解。此初步研究結果展示了mRNA疫苗在精確靶向中的效果。
2.2 高效是精準治療的另一個關鍵點
mRNA疫苗可同時編碼多種抗原，從而大大提高其腫瘤靶向功效。符合這一要求的mRNA疫苗能夠誘導先天性免疫和適應性免疫，從而發揮高效的抗腫瘤作用。例如，DCs能通過模式識別受體吞噬外源mRNA，激活一系列促炎癥相關的信號通路，從而增強先天免疫功能。在刺激適應性免疫方面，外源mRNA編碼的蛋白質會通過降解為肽，隨后被轉運到內質網，加載到MHC-Ⅰ分子上，運輸到細胞表面，并最終呈遞給并激活CD8+ T細胞[41]。
2.3 安全性對于精準治療也至關重要
mRNA不會整合到宿主基因組序列中，因此不存在插入突變的風險；同時，mRNA的生產不涉及有毒化學物質，也不會有細胞培養過程病毒污染的風險；此外，mRNA可被RNA酶快速降解，其半衰期是可調控的，這確保了mRNA編碼蛋白質表達是可控的[42]。最顯著的例子是mRNA新冠疫苗BNT162b2和mRNA1273，它們都在臨床試驗中表現出高安全性和良好的耐受性[43-44]。
2.4 經濟性是精準治療的重要原則
mRNA可以通過使用DNA模板、三磷酸核糖核苷酸和重組酶在體外生產，這大大縮短了生產時間，并可以實現批量生產，從而降低生產成本。mRNA疫苗的生產過程只需約10 d，比其他類型的疫苗生產周期短[45]，這種快速生產能力意味著在腫瘤診斷后的短時間內即可開始治療。從工業角度來看，約1 μg的DNA模板可以生成數百μg的mRNA。實際上，僅需約10 g的mRNA就能生產出高達10萬劑的疫苗。 mRNA疫苗的生產既方便又經濟，符合精準治療的經濟原則。
3 胰腺癌mRNA疫苗的研制策略
mRNA疫苗因其精確靶向、高效、安全和經濟方便而有望提供個體化的胰腺癌治療。越來越多的證據表明，個體化胰腺癌mRNA疫苗的開發過程可分為3個關鍵模塊，包括腫瘤抗原識別、區分免疫亞型和mRNA疫苗構建。
3.1 腫瘤抗原識別
mRNA疫苗的核心理念是引導免疫系統識別并攻擊特定的腫瘤相關抗原或新抗原[14]。腫瘤相關抗原是癌細胞中高水平表達的蛋白質，而新抗原是癌細胞突變后產生的全新蛋白質。理想的候選疫苗應具備以下特征：腫瘤細胞特有、參與腫瘤發生和發展、不被免疫系統耐受、對抗腫瘤免疫有刺激作用[46]。因此，抗原選擇是開發疫苗的第一步。目前癌癥免疫治療的靶點包括腫瘤相關抗原、腫瘤特異性抗原及MHC-Ⅱ-肽。
3.1.1 腫瘤相關抗原
腫瘤相關抗原是一種在正常組織中表達但在腫瘤組織中過度表達的抗原，它具有腫瘤特異性弱、中樞免疫耐受性強、免疫原性弱等特點。盡管腫瘤相關抗原有很多缺點，但其廣譜性使它對低腫瘤突變負荷的患者可能更為適合。編碼腫瘤相關抗原的mRNA癌癥疫苗通過針對癌細胞表面相對于正常細胞過度表達的抗原，誘導特異性免疫反應，這一過程包括確定患者腫瘤細胞表達的腫瘤相關抗原并設計編碼這些抗原的mRNA序列；隨后mRNA被遞送入免疫細胞，翻譯并加工成MHC-Ⅰ/Ⅱ類復合物，然后呈現在這些細胞表面，這種表現會觸發特異性針對表達這些抗原細胞的免疫反應。如今使用多種腫瘤相關抗原組合開發mRNA疫苗已成為一種趨勢。2009年Weide等[47]使用編碼黑色素瘤6種腫瘤相關抗原的mRNA疫苗，并以粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子為佐劑，對21例黑色素瘤患者進行了Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，結果表明，疫苗能顯著減少免疫抑制細胞（Foxp3+/CD4+ T細胞）的數量且無不良反應。近年推出的CV8102 mRNA疫苗，在臨床前測試中展現了較好的抗腫瘤效果。目前，這款疫苗已進入臨床試驗階段，為包括胰腺癌在內的抗癌治療帶來了新曙光[48]。
3.1.2 腫瘤特異性抗原
與腫瘤相關抗原不同，腫瘤特異性抗原只在腫瘤細胞中表達，具有很強的免疫原性、高度的個體性和表位多樣性，因此是個體化疫苗的理想靶點。設計個體化的抗胰腺癌mRNA疫苗首先要通過比較腫瘤和配對正常組織的新一代測序數據來識別出腫瘤特異性非同義突變[49]，然后應用計算新抗原預測管道的相關方法來驗證突變基因的表達，并預測突變基因產生的肽與MHC等位基因的結合親和力[50]。高表達轉錄本與T細胞反應的增強相關，可彌補突變MHC的低結合親和力。此外，單一的MHCⅠ結合型腫瘤特異性抗原是不夠的，還需要額外的MHCⅡ結合型腫瘤特異性抗原才能產生真正有效的抗腫瘤免疫力[51]。MHCⅡ蛋白與抗原肽之間的結合是T細胞識別非自身抗原或腫瘤相關抗原，從而啟動體液免疫和細胞免疫的關鍵步驟。
3.1.3 MHCⅡ-肽的鑒定
由于MHCⅡ上的每個基因座（即人類白細胞DR抗原、DP抗原和DQ抗原）有多種不同的等位基因，使得MHCⅡ基因具有高度多態性，這使得其與肽的結合預測變得更加復雜。為了大規模掃描識別新抗原、開發腫瘤疫苗和設計藥物，研究者們開發了許多計算方法來促進MHCⅡ-肽的鑒定。預測MHC-肽結合可能性的計算方法一般有3種：評分函數、基于機器學習的方法和共識方法[52]。近年來，基于大量MHC ligand和結合數據的預測方法，如NetMHCⅡpan-4.1[53]和MixMHC2pred[54]，已經達到了非常高的預測精度，受試者操作特征曲線下面積已超過0.9。盡管這些算法能夠預測MHC-肽的結合，但它們還不能區分復合物半衰期（即動力學穩定性）的實驗差異。由于目前大多數疫苗中只有一小部分肽能引起CD8+ T細胞反應，因此提高新抗原肽-MHC的實際穩定性非常重要。穩定性預測工具NetMHCstabpan 在識別免疫原性突變方面表現出色，由Fasoulis等[55]開發的TLStab和TLImm模型分別在不同的穩定性和免疫原性測試集上表現出相當或更好的性能。
隨著計算生物學的不斷發展，通過篩選過表達和突變基因以及預后和APC相關候選基因來識別腫瘤抗原的途徑已經成熟。值得注意的是，目前還沒有制定出能權衡以上每個特征的具體方法來為mRNA疫苗的開發篩選出最佳候選基因，但計算生物學的進展會讓我們建立起一種準確、靈敏的方法來確定胰腺癌的有效候選基因，從而開發出個性化的mRNA疫苗。
3.2 區分免疫亞型
腫瘤的免疫療法為各種實體瘤的治療帶來了革命性的變化。然而目前的免疫療法包括癌癥疫苗、溶瘤病毒療法、免疫檢查點導向免疫療法等，在提高PDAC患者生存率方面成效有限。
PDAC對免疫療法的免疫耐受可歸因于其復雜的免疫抑制微環境、低突變負荷、T細胞浸潤差等特點[56]。免疫治療后腫瘤的后續結果是進展還是消退，在很大程度上取決于腫瘤內的免疫環境，這種環境由各種細胞類型組成，如適應性免疫細胞、巨噬細胞、DCs、自然殺傷細胞和其他先天性免疫細胞。PDAC對新的免疫療法有很強的抵抗力，這是因為不同的免疫細胞之間相互協作，形成了一種高度免疫抑制的環境，這種環境有助于腫瘤的發展。目前有研究[57]指出，每例PDAC患者都存在復雜的腫瘤免疫微環境，這也是開發mRNA疫苗和選擇合適的疫苗接種患者所需的理論依據。免疫分型可用于反映腫瘤及其微環境的免疫狀態，同時也是選擇合適的免疫聯合療法的準確生物標志物，通過不同的免疫分型能幫助確定適合接種疫苗的患者[58]。
至今研究者們已根據不同的參數、方法和觀點確定了多種胰腺癌亞型。多種免疫學因素，包括免疫相關基因表達譜、免疫細胞組成等，均被用于胰腺癌免疫亞型的分組。Moffitt等[59]根據基因表達譜確定了兩種基質亞型（正常和活化）和兩種腫瘤亞型（基底樣和經典）。最近的有關胰腺癌的免疫分型是由Xing等[57]在2021年發布，在其研究中，通過分析ICGC數據庫中PDAC樣本的免疫相關基因表達譜，確定了5個免疫亞型，分別命名為IS1～IS5，其中IS1和IS2表現出免疫激活表型，即免疫學“熱”表型，與其他亞型相比生存率更高；IS4和IS5腫瘤是免疫學“冷”表型，與較高的腫瘤突變負荷相關；具有或不具有免疫抑制微環境的免疫性“冷”腫瘤的IS4和IS5腫瘤患者可能是mRNA疫苗的合適候選者；研究還發現，免疫細胞死亡調節劑、免疫檢查點、CA125和CA19-9在5種免疫亞型中的表達也存在差異，因此指出，IS1～IS5的免疫分型在預測腫瘤突變負荷和體細胞突變率以及作為預測PDAC免疫治療預后的生物標志物方面有很大的前景。
腫瘤組織中T細胞和其他免疫細胞的浸潤和活化以及免疫抑制細胞的抑制作用，在很大程度上決定了mRNA疫苗對具有特定免疫亞型的癌癥患者的治療潛力。雖然mRNA疫苗可以激活并促進T細胞向腫瘤浸潤，但這些細胞的進入在很大程度上仍會受到胰腺癌細胞脫膜間質的干擾[60]。因此，胰腺癌治療亟需mRNA疫苗與其他療法（而非單一疫苗）相結合，以及用于預測聯合療法治療反應的生物標志物。免疫原性化療和基質調節可通過改善免疫“冷”腫瘤的免疫原性和T細胞浸潤來增強mRNA疫苗的有效性[61]。此外，mRNA疫苗與免疫檢查點抑制劑相結合可改善免疫“熱”腫瘤的T細胞浸潤和功能[62]。mRNA疫苗與免疫檢查點抑制劑、過繼細胞療法、溶瘤病毒治療等其他免疫治療方法以及化療等傳統治療方式的聯合使用是目前研究的熱點。因此，免疫亞型有潛力作為預測聯合治療效果的準確生物標志物。總之，在免疫亞型、匹配的生物標志物和治療方法的指導下，聯合療法可提高mRNA疫苗治療胰腺癌的療效。
3.3 mRNA疫苗構建
mRNA疫苗中的mRNA是通過體外轉錄產生的，體外轉錄已成為設計和制備mRNA的常用技術，它以線性DNA為模板，在噬菌體RNA聚合酶的輔助下制備mRNA。在實際應用mRNA癌癥疫苗之前，必須解決幾個關鍵問題：包括遞送、穩定性、翻譯和免疫原性[41,63-64]。
3.3.1 遞送
由于裸mRNA的大小、降解性、電荷等原因，除了未成熟的DCs可以通過噬菌體吞噬途徑有效攝取mRNA外，裸mRNA無法有效穿過細胞膜進入細胞質[41]。為了更有效地將mRNA遞送到抗原呈遞細胞，必須適當選擇和優化mRNA制劑和給藥途徑。① 制劑。脂質納米顆粒作為mRNA遞送系統在臨床試驗中被廣泛研究[65]。新冠疫苗BNT162b2和mRNA1273均采用脂質納米顆粒形式[43,44]。相比于陽離子脂質，脂質納米顆粒代表的可電離脂質能在不同情況下攜帶不同的電荷，在制備過程的酸性緩沖液中帶正電，這有利于mRNA的封裝；而在生理條件下它們會變成中性，從而降低體內毒性并延長循環半衰期[66]。同樣，擁有自適應活性的脂質納米顆粒還是一種多功能佐劑，可提高傳統和下一代疫苗平臺的功效[67]。最近，為了更好地遞送mRNA，研究人員還測試了聚合物基納米顆粒[68]、脂質-聚合物混合納米顆粒[44]、無機納米載體[69]和細胞外囊泡[70]。聚合物基納米顆粒和無機納米載體的特點是具有超強的穩定性，而DCs和細胞外囊泡則具有顯著的免疫調節能力和生物相容性[71,72]。② 給藥途徑。mRNA遞送過程中任何一個環節出現問題都會影響療效。給藥途徑作為mRNA癌癥疫苗臨床應用的重要因素之一，對靶蛋白的翻譯效率和疫苗在體內的分布都具有很大影響[73]。目前已獲得批準的SARS-CoV-2 mRNA疫苗采用的是肌肉注射，但對于mRNA疫苗的最佳給藥途徑尚未達成共識。mRNA癌癥疫苗的每種給藥途徑包括肌肉注射、皮下注射、結節內注射、皮內注射和鼻內注射，都有其獨特的優點和局限性，目前其最佳給藥途徑仍在被不斷探討[74]。
3.3.2 穩定性
在成功遞送mRNA后，還必須適當調節mRNA在體內轉錄的半衰期，因為有多種因素會影響基于mRNA療法的藥效學和藥代動力學。體外合成的mRNA極不穩定，進入人體后容易失活。通過對mRNA的修飾可以提高蛋白質合成的速度和mRNA的功能半衰期。其中包括優化多聚（A）尾、密碼子、5′端帽、多聚-A尾、非翻譯區以及編碼蛋白質的開放閱讀框，以提高mRNA的穩定性[41]。
3.3.3 免疫原性
除了遞送和穩定性，還必須考慮免疫原性。免疫刺激不足會導致T細胞喪失和腫瘤耐受。不同于需要鋁鹽（明礬）、單磷酸脂質A或Toll樣受體激動劑等佐劑的肽或蛋白疫苗，mRNA可以被模式識別受體識別，而且它本身具有一定的免疫刺激功能，通過刺激先天性免疫來刺激干擾素-γ的產生，干擾素-γ是輔助性T淋巴細胞、趨化因子及其受體等炎癥因子的主要調節因子，它們之間相互作用來調節機體的免疫環境[75]。目前，干擾素-γ介導的先天免疫反應可以通過體外轉錄或高效液相色譜純化mRNA，以及優化序列和轉錄后純化來降低[76]。
3.3.4 翻譯
應避免激活雙鏈RNA識別的蛋白激酶，因為觸發這一信號通路會影響mRNA的翻譯。在體外轉錄過程中加入天然存在的修飾核苷，如2-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷或假尿苷，可阻礙雙鏈RNA的形成，從而抑制蛋白激酶R的激活[77]。
總之，mRNA疫苗構建策略的進步，在很大程度上提高了其治療胰腺癌的療效。
4 mRNA疫苗在胰腺癌治療中的應用情況
最近，由紀念斯隆凱特琳癌癥中心、BioNTech和基因泰克組成的研究小組在使用個性化mRNA癌癥疫苗治療PDAC的研究中取得了突破[7]，在Ⅰ期臨床試驗中，研究團隊為16例PDAC患者在手術切除后注射了表達多達20個新抗原的個性化mRNA疫苗——自體cevumeran，該疫苗通過靜脈注射使用脂質納米顆粒遞送，并與化療（mFOLFIRINOX方案）和免疫檢查點療法（抗PD-L1單克隆抗體）聯合使用，臨床試驗結果顯示，50%的受試者體內T細胞擴增反應顯著，證實了這種個性化mRNA疫苗能夠有效激發并增強免疫應答；經過中位18個月的隨訪，與對照組相比，獲得疫苗增強T細胞的患者中位無復發生存期明顯延長，該研究結果證實了個性化mRNA疫苗在PDAC治療中的有效性。此外，Zhang等[78]探討了PDAC的鐵死亡調控因子與免疫微環境和PD-L1的關系。研究發現，鐵死亡調控因子FANCD2在PDAC中上調，與總體生存、免疫微環境和藥物敏感性密切相關，為mRNA疫苗和個性化免疫治療提供了理論基礎，具有重要的臨床應用潛力。
5 結論與展望
要實現個性化胰腺癌疫苗的關鍵在于發現有效的腫瘤抗原、優化疫苗結構以及區分免疫亞型。盡管PDAC的突變率相對較低，mRNA疫苗仍能激發T細胞對PDAC特異的新抗原產生反應。因此，個性化mRNA疫苗是一種很有前景的胰腺癌治療策略。
值得注意的是，獲得足夠的腫瘤樣本是目前鑒定個性化腫瘤抗原和免疫亞型從而開發個性化mRNA疫苗的前提。由于癥狀隱匿和缺乏精準檢測手段，胰腺癌多數確診時已進展至晚期或轉移階段，僅15%～20%的患者可接受手術治療，導致腫瘤樣本主要依賴于活檢獲取[4]。然而胰腺腫瘤間及腫瘤內的異質性限制了活檢樣本的實際應用價值，不足以支持mRNA疫苗的個性化設計和構建，以及確定患者是否適合接受聯合治療。當前的解決方案是新輔助治療，它主要用于交界性可切除和局部晚期胰腺癌患者。對于交界性可切除胰腺癌，新輔助治療可以縮小腫瘤，提高手術成功率并簡化手術程序。而對于局部晚期胰腺癌，治療后的手術完全切除率為3%～79%[79]。通過新輔助治療縮小腫瘤，能提高手術成功率，并獲取充足的腫瘤樣本，這對于開發mRNA疫苗的腫瘤抗原和免疫亞型至關重要。
目前大多數癌癥mRNA疫苗是治療性的，而非預防性的。作為單一療法使用時，這些疫苗需要足夠的效力，且要多次給藥才能誘導抗腫瘤免疫反應。針對胰腺癌等具有高度免疫抑制和異質性腫瘤微環境的癌癥，治療性mRNA疫苗與其他免疫治療方法結合使用更可能成功。此外，開發預防性mRNA疫苗可能是應對這種棘手疾病的另一重要策略。預防性mRNA疫苗主要用于預防病毒感染，因為其抗原具有外生性，結構簡單，易于識別。然而，到目前為止，胰腺癌預防性疫苗的開發仍處于起步階段，主要原因在于胰腺癌發病的復雜性及疫苗接種效果難以評估。
隨著多組學的發展和交叉學科的融合進步，未來腫瘤特異性抗原的篩選將越來越精確。同時，不同癌癥類型或分期的患者也將得到合適的聯合治療，從而實現真正有效的個性化治療。此外，我們期望越來越多的預防性癌癥mRNA疫苗能夠問世，以真正實現癌癥的防患于未然。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：黃鴻才負責文獻查閱、文獻總結和文章撰寫；余華負責指導及文章審閱修改。