引用本文： 曹靖靖, 寇振宇, 王晴, 莊彤彤, 東莉潔, 王林妮. 沉默Nodal抑制高糖條件下培養的視網膜血管內皮細胞的生物學行為. 中華眼底病雜志, 2024, 40(2): 136-141. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230423-00181 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中華眼底病雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
持續性高血糖是糖尿病視網膜病變（DR）發生的重要誘因。研究發現，高血糖可促使血管內皮生長因子（VEGF）的增加，進而損傷視網膜內皮細胞，導致視網膜血管生成[1-2]。目前抗VEGF藥物治療可引發纖維化等并發癥發生[3]。因此，抗眼部新生血管尚需開發更安全有效的治療方法。轉化生長因子-β（TGF-β）信號傳導的分子途徑在新生血管形成方面發揮重要作用[4]。Nodal是TGF-β超家族成員之一。既往文獻報道，Nodal可促進乳腺癌誘導的內皮細胞遷移和管腔形成，并主要通過上調乳腺癌細胞促進血管生成因子的表達和分泌[5]。Nodal可通過Smad2/3通路促進乳腺癌血管生成模擬物的形成[6]。然而，目前關于Nodal在新生血管方面的研究鮮見報道。本研究通過體外細胞實驗分析Nodal在高糖環境中對猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A細胞）增殖、遷移、管腔形成的作用，并初步探討Nodal對細胞內磷酸化細胞外調節蛋白激酶（pERK）1/2水平的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
RF/6A細胞由天津醫科大學眼科研究所自行保存；小干擾RNA（siRNA，河馬生物科技有限公司）；RPMI 1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、牛血清白蛋白（BSA）、山羊血清、Triton X-100（北京索萊寶科技有限公司）；Matrigel（美國BD公司）。
1.2 細胞培養和分組
RF/6A細胞置于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養基中，37°C、5%CO2培養箱中培養。取6次傳代或之前細胞進行實驗。細胞分為正常組（N組）、甘露醇組（M組）、高糖組（HG組）、高糖聯合NC處理組（HG+NC組）、高糖聯合小干擾Nodal（siNodal）處理組（HG+siNodal組）。M組、HG組細胞培養基分別加入25 mmol/L甘露醇、25 mmol/L葡萄糖處理[7]。HG+siNodal組在25 mmol/L葡萄糖培養基礎上，根據前期預實驗結果，加入siNodal；HG+NC組轉染非特異siRNA。N組細胞正常培養。各組細胞培養48 h后進行后續實驗。
1.3 方法
噻唑藍（MTT）比色法檢測Nodal對RF/6A細胞增殖的影響。各組細胞以1×105個/ml密度接種于96孔板[8]。每孔加入MTT孵育4 h后棄上清，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），室溫靜置15 min。采用酶鏈免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值[8]。讀取A值后，棄去DMSO，4%多聚甲醛固定30 min，加入DAPI染色，熒光顯微鏡觀察拍照。每組設3個復孔，實驗重復3次。
細胞劃痕實驗測定Nodal對RF/6A細胞遷移能力的影響。各組細胞以6×105個/孔密度接種于6孔板中。生長融合為單層細胞后，應用100～1 000 μl微量加樣槍頭于孔板中央作“十”字形劃痕[9]，并將此時計作0 h，繼續培養12 h后于相同劃痕位置再次拍照，觀察各孔細胞向裸區的遷移情況，并應用cellSens Standard軟件測量裸區面積[10]。實驗重復3次，按以下公式計算遷移率，遷移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。
Matrigel體外三維成型法檢測Nodal對RF/6A細胞管腔形成的影響。Matrigel膠涂覆于24孔培養板上，37 ℃下聚合30 min[11]。各組細胞以1×105個/孔密度接種于細胞基質凝膠表面，37 ℃培養箱中孵育。6 h后，蔡司數碼相機拍攝管腔形成情況。每組隨機選取5張不同視野照片，計數管腔形成數量并取平均值。
蛋白質免疫印跡法（Western blots）檢測siNodal轉染效率和RF/6A細胞內pERK1/2蛋白相對表達量。提取各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入40 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。BSA封閉，一抗pERK1/2、Nodal 4 ℃過夜孵育（β-actin肌動蛋白作為陽性對照），PBS洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復3次；加入化學發光劑，全自動化學發光圖像分析儀曝光[12]。采用Bio-Rad軟件灰度分析法對條帶強度進行半定量分析。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測siNodal轉染效率。384孔板中依此加入2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合，加樣全程在冰上避光操作。以離心半徑7 cm、1 500 r/min離心5 min。置于qRT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以磷酸甘油醛脫氫酶為內參照，依照公式2-ΔΔCt計算Nodal mRNA相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析。采用Graph-prism軟件對所獲得數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 轉染siNodal后Nodal表達受到抑制
與N組、HG+NC組比較，HG+siNodal組細胞內Nodal蛋白、mRNA相對表達量顯著下降，差異有統計學意義（F=33.469、38.191，P＜0.01）（圖1）。
圖1
siNodal轉染效率驗證
1A示電泳圖；1B、1C分別示3組Nodal蛋白、mRNA相對表達量比較（
2.2 沉默Nodal表達可抑制高糖誘導的RF/6A細胞增殖
與N組、M組比較，HG組細胞增殖顯著增多；與HG+NC組比較，HG+siNodal組細胞增殖顯著降低（圖2A～2E）。N組、M組、HG組細胞增殖率比較，差異有統計學意義（F=33.176，P＜0.01）；HG組、HG+NC組、HG+siNodal組細胞增殖率比較，差異有統計學意義（F=28.548，P＜0.01）（圖2F）。
圖2
Nodal在高糖誘導的RF/6A細胞增殖中的作用
2A～2E分別示N組、M組、HG組、HG+NC組、HG+siNodal組熒光顯微鏡像（DAPI，標尺：20 μm），藍色熒光代表細胞核，用來表征細胞數量；2F示5組細胞增殖率比較（
2.3 沉默Nodal表達可抑制高糖誘導的RF/6A細胞遷移
細胞劃痕實驗檢測結果顯示，細胞培養12 h后，N組、M組、HG+siNodal組僅有少量細胞遷移進入裸區，HG組、HG+NC組可見大量細胞遷移進入裸區（圖3A～3E）。與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞遷移能力顯著下降，差異有統計學意義（F=24.182，P＜0.01）（圖3F）。
圖3
Nodal對高糖誘導的RF/6A細胞遷移能力的影響
3A～3E分別示N組、M組、HG組、HG+NC組、HG+siNodal組細胞培養48 h倒置相差顯微鏡像（標尺：100 μm），N組、M組、HG+siNodal組僅有少量細胞遷移進入裸區，HG組、HG+NC組可見大量細胞遷移進入裸區；3F示5組細胞遷移率比較（
2.4 沉默Nodal可抑制高糖誘導的RF/6A細胞的管腔形成
Matrigel實驗結果顯示，細胞接種6 h后，與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞管腔形成數量顯著減少，差異有統計學意義（F=52.643，P＜0.05）（圖4）。
圖4
Nodal對高糖誘導的RF/6A細胞管腔形成能力的影響
4A～4E分別示N組、M組、HG組、HG+NC組、HG+siNodal組細胞顯微鏡像（標尺：100 μm），與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞管腔形成數量顯著減少；4F示5組細胞管腔形成數量比較（
2.5 沉默Nodal可降低高糖誘導的RF/6A細胞中pERK1/2表達
與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞內pERK1/2蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（F=44.462，P＜0.01）（圖5）。
圖5
Nodal對高糖誘導的RF/6A細胞中pERK1/2表達的影響
5A示電泳圖；5B示5組細胞內pERK1/2蛋白相對表達量比較（
3 討論
視網膜對高糖水平變化極為敏感[13]。視網膜新生血管由于持續性高血糖導致視網膜微血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成。高血糖可導致一系列病理過程，并導致組織和器官在代謝、功能和形態結構方面異常。本研究采用高葡萄糖水平刺激RF/6A細胞，一定程度模擬DR患者的眼部環境，結果發現沉默Nodal表達可抑制高糖誘導的RF/6A細胞增殖、遷移及管腔形成。
TGF-β信號通路是抗血管生成治療的新靶點，Nodal作為TGF-β超家族成員之一，逐漸被認識到其在血管生成中的重要性。沉默Nodal表達后可抑制人膠質瘤的血管生成和生長，其誘導的VEGF表達可能至少部分通過細胞外調節蛋白激酶（ERK）1/2-缺氧誘導因子1α介導的信號通路介導[14]。另有研究發現，Nodal激活了前列腺癌細胞的增殖能力和人臍靜脈內皮細胞的遷移和成管能力[15]。本研究結果顯示，沉默Nodal表達后可抑制高糖誘導的RF/6A細胞的管腔形成能力，可能在抑制新生血管形成中占據重要地位。
ERK途徑在調節血管生成中起著至關重要的作用，ERK信號傳導不僅參與細胞存活和侵襲的各種腫瘤轉化，而且還調節腫瘤上皮-間充質轉化和血管生成的轉錄因子，激活肝細胞癌中的ERK1/2信號傳導，可增強肝細胞分泌VEGF-A并促進血管生成[16]。有研究發現，抑制ERK1/2信號通路的激活可抑制視網膜、角膜的新生血管形成[17-18]。本研究結果顯示，沉默Nodal表達可降低高糖誘導的RF/6A細胞的pERK1/2水平，提示Nodal可能通過調節ERK1/2通路參與新生血管的形成。
本研究結果顯示，沉默Nodal表達后可降低高糖誘導的RF/6A細胞增殖率、遷移率。此外，還證實沉默Nodal的表達可抑制RF/6A細胞的管腔形成能力，并降低pERK1/2水平，這可能在調節RF/6A細胞對高糖反應的變化中起著至關重要的作用。因此，本研究結果可以表明，Nodal是新生血管眼病的潛在治療靶點。
本研究初步探索了Nodal在高糖誘導的視網膜新生血管疾病中的作用，并證實其可能與抑制pERK1/2的水平有關，但尚未在體內實驗中觀察Nodal作用。未來我們會深入探究，挖掘其在眼部新生血管方面的潛在價值。
持續性高血糖是糖尿病視網膜病變（DR）發生的重要誘因。研究發現，高血糖可促使血管內皮生長因子（VEGF）的增加，進而損傷視網膜內皮細胞，導致視網膜血管生成[1-2]。目前抗VEGF藥物治療可引發纖維化等并發癥發生[3]。因此，抗眼部新生血管尚需開發更安全有效的治療方法。轉化生長因子-β（TGF-β）信號傳導的分子途徑在新生血管形成方面發揮重要作用[4]。Nodal是TGF-β超家族成員之一。既往文獻報道，Nodal可促進乳腺癌誘導的內皮細胞遷移和管腔形成，并主要通過上調乳腺癌細胞促進血管生成因子的表達和分泌[5]。Nodal可通過Smad2/3通路促進乳腺癌血管生成模擬物的形成[6]。然而，目前關于Nodal在新生血管方面的研究鮮見報道。本研究通過體外細胞實驗分析Nodal在高糖環境中對猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A細胞）增殖、遷移、管腔形成的作用，并初步探討Nodal對細胞內磷酸化細胞外調節蛋白激酶（pERK）1/2水平的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
RF/6A細胞由天津醫科大學眼科研究所自行保存；小干擾RNA（siRNA，河馬生物科技有限公司）；RPMI 1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、牛血清白蛋白（BSA）、山羊血清、Triton X-100（北京索萊寶科技有限公司）；Matrigel（美國BD公司）。
1.2 細胞培養和分組
RF/6A細胞置于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養基中，37°C、5%CO2培養箱中培養。取6次傳代或之前細胞進行實驗。細胞分為正常組（N組）、甘露醇組（M組）、高糖組（HG組）、高糖聯合NC處理組（HG+NC組）、高糖聯合小干擾Nodal（siNodal）處理組（HG+siNodal組）。M組、HG組細胞培養基分別加入25 mmol/L甘露醇、25 mmol/L葡萄糖處理[7]。HG+siNodal組在25 mmol/L葡萄糖培養基礎上，根據前期預實驗結果，加入siNodal；HG+NC組轉染非特異siRNA。N組細胞正常培養。各組細胞培養48 h后進行后續實驗。
1.3 方法
噻唑藍（MTT）比色法檢測Nodal對RF/6A細胞增殖的影響。各組細胞以1×105個/ml密度接種于96孔板[8]。每孔加入MTT孵育4 h后棄上清，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），室溫靜置15 min。采用酶鏈免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值[8]。讀取A值后，棄去DMSO，4%多聚甲醛固定30 min，加入DAPI染色，熒光顯微鏡觀察拍照。每組設3個復孔，實驗重復3次。
細胞劃痕實驗測定Nodal對RF/6A細胞遷移能力的影響。各組細胞以6×105個/孔密度接種于6孔板中。生長融合為單層細胞后，應用100～1 000 μl微量加樣槍頭于孔板中央作“十”字形劃痕[9]，并將此時計作0 h，繼續培養12 h后于相同劃痕位置再次拍照，觀察各孔細胞向裸區的遷移情況，并應用cellSens Standard軟件測量裸區面積[10]。實驗重復3次，按以下公式計算遷移率，遷移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。
Matrigel體外三維成型法檢測Nodal對RF/6A細胞管腔形成的影響。Matrigel膠涂覆于24孔培養板上，37 ℃下聚合30 min[11]。各組細胞以1×105個/孔密度接種于細胞基質凝膠表面，37 ℃培養箱中孵育。6 h后，蔡司數碼相機拍攝管腔形成情況。每組隨機選取5張不同視野照片，計數管腔形成數量并取平均值。
蛋白質免疫印跡法（Western blots）檢測siNodal轉染效率和RF/6A細胞內pERK1/2蛋白相對表達量。提取各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入40 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。BSA封閉，一抗pERK1/2、Nodal 4 ℃過夜孵育（β-actin肌動蛋白作為陽性對照），PBS洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復3次；加入化學發光劑，全自動化學發光圖像分析儀曝光[12]。采用Bio-Rad軟件灰度分析法對條帶強度進行半定量分析。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測siNodal轉染效率。384孔板中依此加入2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合，加樣全程在冰上避光操作。以離心半徑7 cm、1 500 r/min離心5 min。置于qRT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以磷酸甘油醛脫氫酶為內參照，依照公式2-ΔΔCt計算Nodal mRNA相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析。采用Graph-prism軟件對所獲得數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 轉染siNodal后Nodal表達受到抑制
與N組、HG+NC組比較，HG+siNodal組細胞內Nodal蛋白、mRNA相對表達量顯著下降，差異有統計學意義（F=33.469、38.191，P＜0.01）（圖1）。
圖1
siNodal轉染效率驗證
1A示電泳圖；1B、1C分別示3組Nodal蛋白、mRNA相對表達量比較（
2.2 沉默Nodal表達可抑制高糖誘導的RF/6A細胞增殖
與N組、M組比較，HG組細胞增殖顯著增多；與HG+NC組比較，HG+siNodal組細胞增殖顯著降低（圖2A～2E）。N組、M組、HG組細胞增殖率比較，差異有統計學意義（F=33.176，P＜0.01）；HG組、HG+NC組、HG+siNodal組細胞增殖率比較，差異有統計學意義（F=28.548，P＜0.01）（圖2F）。
圖2
Nodal在高糖誘導的RF/6A細胞增殖中的作用
2A～2E分別示N組、M組、HG組、HG+NC組、HG+siNodal組熒光顯微鏡像（DAPI，標尺：20 μm），藍色熒光代表細胞核，用來表征細胞數量；2F示5組細胞增殖率比較（
2.3 沉默Nodal表達可抑制高糖誘導的RF/6A細胞遷移
細胞劃痕實驗檢測結果顯示，細胞培養12 h后，N組、M組、HG+siNodal組僅有少量細胞遷移進入裸區，HG組、HG+NC組可見大量細胞遷移進入裸區（圖3A～3E）。與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞遷移能力顯著下降，差異有統計學意義（F=24.182，P＜0.01）（圖3F）。
圖3
Nodal對高糖誘導的RF/6A細胞遷移能力的影響
3A～3E分別示N組、M組、HG組、HG+NC組、HG+siNodal組細胞培養48 h倒置相差顯微鏡像（標尺：100 μm），N組、M組、HG+siNodal組僅有少量細胞遷移進入裸區，HG組、HG+NC組可見大量細胞遷移進入裸區；3F示5組細胞遷移率比較（
2.4 沉默Nodal可抑制高糖誘導的RF/6A細胞的管腔形成
Matrigel實驗結果顯示，細胞接種6 h后，與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞管腔形成數量顯著減少，差異有統計學意義（F=52.643，P＜0.05）（圖4）。
圖4
Nodal對高糖誘導的RF/6A細胞管腔形成能力的影響
4A～4E分別示N組、M組、HG組、HG+NC組、HG+siNodal組細胞顯微鏡像（標尺：100 μm），與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞管腔形成數量顯著減少；4F示5組細胞管腔形成數量比較（
2.5 沉默Nodal可降低高糖誘導的RF/6A細胞中pERK1/2表達
與HG組、HG+NC組比較，N組、M組、HG+siNodal組細胞內pERK1/2蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（F=44.462，P＜0.01）（圖5）。
圖5
Nodal對高糖誘導的RF/6A細胞中pERK1/2表達的影響
5A示電泳圖；5B示5組細胞內pERK1/2蛋白相對表達量比較（
3 討論
視網膜對高糖水平變化極為敏感[13]。視網膜新生血管由于持續性高血糖導致視網膜微血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成。高血糖可導致一系列病理過程，并導致組織和器官在代謝、功能和形態結構方面異常。本研究采用高葡萄糖水平刺激RF/6A細胞，一定程度模擬DR患者的眼部環境，結果發現沉默Nodal表達可抑制高糖誘導的RF/6A細胞增殖、遷移及管腔形成。
TGF-β信號通路是抗血管生成治療的新靶點，Nodal作為TGF-β超家族成員之一，逐漸被認識到其在血管生成中的重要性。沉默Nodal表達后可抑制人膠質瘤的血管生成和生長，其誘導的VEGF表達可能至少部分通過細胞外調節蛋白激酶（ERK）1/2-缺氧誘導因子1α介導的信號通路介導[14]。另有研究發現，Nodal激活了前列腺癌細胞的增殖能力和人臍靜脈內皮細胞的遷移和成管能力[15]。本研究結果顯示，沉默Nodal表達后可抑制高糖誘導的RF/6A細胞的管腔形成能力，可能在抑制新生血管形成中占據重要地位。
ERK途徑在調節血管生成中起著至關重要的作用，ERK信號傳導不僅參與細胞存活和侵襲的各種腫瘤轉化，而且還調節腫瘤上皮-間充質轉化和血管生成的轉錄因子，激活肝細胞癌中的ERK1/2信號傳導，可增強肝細胞分泌VEGF-A并促進血管生成[16]。有研究發現，抑制ERK1/2信號通路的激活可抑制視網膜、角膜的新生血管形成[17-18]。本研究結果顯示，沉默Nodal表達可降低高糖誘導的RF/6A細胞的pERK1/2水平，提示Nodal可能通過調節ERK1/2通路參與新生血管的形成。
本研究結果顯示，沉默Nodal表達后可降低高糖誘導的RF/6A細胞增殖率、遷移率。此外，還證實沉默Nodal的表達可抑制RF/6A細胞的管腔形成能力，并降低pERK1/2水平，這可能在調節RF/6A細胞對高糖反應的變化中起著至關重要的作用。因此，本研究結果可以表明，Nodal是新生血管眼病的潛在治療靶點。
本研究初步探索了Nodal在高糖誘導的視網膜新生血管疾病中的作用，并證實其可能與抑制pERK1/2的水平有關，但尚未在體內實驗中觀察Nodal作用。未來我們會深入探究，挖掘其在眼部新生血管方面的潛在價值。
