棘球蚴病（又稱“包蟲病”）是由棘球絳蟲感染所致的人獸共患病，主要分囊型和泡型。治療以手術切除為主、藥物為輔，手術難度高，藥物副作用顯著。切斷傳染源和改善衛生條件為主要防控手段。但棘球蚴病流行地區自然和社會環境復雜，其防控仍面臨嚴峻挑戰。疫苗是控制感染性疾病最經濟和有效的手段。目前獸用囊型棘球蚴病疫苗（重組Eg95蛋白）在家畜中取得了較好的減囊效果，不僅減少了畜牧業經濟損失和傳染源，也為人用棘球蚴病疫苗的研發奠定了理論基礎。優化獸用棘球蚴病疫苗和開發人用棘球蚴病疫苗，將推進棘球蚴病的防控與消除進程，提高人類健康水平。已報道的棘球蚴病候選疫苗類型包括蟲體源蛋白、重組蛋白、核酸、合成表位和載體疫苗，通過誘導細胞因子、效應細胞和保護性抗體發揮免疫防御功能。為加快獸用棘球蚴病疫苗的優化和促進人用棘球蚴病疫苗的研發，現對目前國內外關于棘球蚴病疫苗的最新研究進展進行歸納總結及分析，以探討棘球蚴病疫苗研發過程中面臨的挑戰及解決方案，為棘球蚴病的疫苗研發提供理論支持和實踐指導。
引用本文： 顧焓霏, 牟軍, 劉杰. 棘球蚴病的疫苗研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2024, 31(10): 1170-1180. doi: 10.7507/1007-9424.202408103 復制
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棘球蚴病（又稱“包蟲病”）是一種由棘球絳蟲感染引起的人畜共患寄生蟲病，主要分為囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）和泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）兩種類型[1]。人因誤食細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus，Eg）或多房棘球絳蟲（Echinococcus multilocularis，Em）蟲卵而分別感染這兩種疾病 [1]。誤攝入蟲卵內的六鉤蚴在消化道內被孵化和激活，穿透腸黏膜屏障，通過血液（主要）和淋巴循環到達和定植于組織或器官[2]，其中70%定植于肝臟 [3-4]。人感染棘球絳蟲后，CE在寄生器官內早期主要表現為肉芽腫，隨著肉芽腫的生長，外層纖維囊壁不斷纖維化增生，最終形成纖維結締組織包被的囊腫；AE囊腫在寄生器官內浸潤式生長，不斷增殖產生新囊泡并深入組織，還可以通過淋巴管道和血管轉移到遠端組織，類似腫瘤的浸潤和擴散[5]。棘球蚴囊腫破裂可引起過敏反應，甚至休克，因囊腫破裂后外漏的原頭蚴隨囊液流入破裂口周圍而形成繼發性棘球蚴囊腫 [6]。
全球估計有超過100萬人受到棘球蚴病的影響，而僅CE相關的治療費用及畜牧業損失每年高達30億美元 [7]。在阿根廷、秘魯、東非、中亞、中國等地區或國家，CE患病率高達5%～10% [8]。在中國2012–2016年棘球蚴病流行病學調查中，全國共有368個棘球蚴病流行縣，人群患病率為0.28%，患病達166 098例 [9]。其中石渠縣是流行較為嚴重的地區之一，2017年AE患病率高達8.72% [10]。切斷傳染源和改善衛生條件是當前全球公認的主要防控手段。但由于流行地區自然和社會環境復雜，棘球蚴病的防控仍面臨嚴峻挑戰。目前獸用CE疫苗（重組Eg95蛋白）在家畜中取得了較好的減囊效果，在一定程度上減緩了棘球蚴病的傳播和流行，也為人用棘球蚴病疫苗的研發奠定了理論基礎。為了加快獸用棘球蚴病疫苗的優化和促進人用棘球蚴病疫苗的研發，現對目前國內外棘球蚴病疫苗的最新研究進展進行歸納總結，探討棘球蚴病疫苗研發過程中面臨的挑戰與解決方案，為棘球蚴病的疫苗研發提供理論支持和實踐指導。
1 棘球蚴病疫苗開發的背景
近年來，棘球蚴病的診療水平有了逐步提高，治療方式包括手術切除、藥物聯合治療（苯并咪唑類化合物）和對癥治療 [11]。根據國內外學者共識，為最大限度地根治疾病、延長患者壽命及提高患者生命質量，CE以手術治療為主，藥物治療為輔；AE的治療包括手術、介入及藥物聯合治療 [5]。然而治療后的復發率較高，其中CE的復發率約為6.5% [7]，AE的復發率為2%～5% [12]。若未治療、治療不及時或治療不當，CE患者10～15年病死率高達90% [13]。由于手術切除的復雜性和藥物治療的長期性，棘球蚴病的治療費用昂貴，在治療和管理方面均面臨巨大挑戰 [8]。因此，預防及早期診斷對于棘球蚴病的治療、減輕病情和減少并發癥具有重要意義。
棘球蚴病的臨床診斷主要依據患者的流行病學史、臨床表現、影像學檢查及實驗室檢查包括病原學檢查的綜合應用。其中，影像學檢查是棘球蚴病診斷的重要手段 [13]。但由于棘球蚴囊腫在人體內生長緩慢，早期較為隱匿，隨病灶長大才顯現出器官和鄰近組織擠壓相關的臨床癥狀，患者就醫晚或在體檢中偶然發現 [11, 14]。以免疫學為基礎的棘球蚴病快速診斷試劑盒不僅廣泛應用于流行病學篩查，也作為確認影像檢查結果的手段用于棘球蚴病的診斷和鑒別診斷，但當前血清學檢測的靈敏性和特異性尚待提高。中國食品藥品監督管理總局批準上市和使用的3種臨床輔助診斷抗體檢測試劑（新疆貝斯明、上海新吉而和珠海海泰）的靈敏度為90.8%～94.3%、特異性為75.7%～83.3% [15]。經手術確認的CE患者的血清學檢測的靈敏度和特異性均約為60%～90% [13]。AE的血清學診斷可靠性較高，以Em2為抗原的ELISA檢測靈敏度和特異性均可達90% [14]；此外，與其他寄生蟲的交叉反應性限制了免疫學檢測方法的準確度 [16-17]。因此，棘球蚴病免疫學診斷在特異性、敏感性和交叉反應性方面還面臨挑戰，診斷結果有待綜合考慮和評估。
棘球絳蟲的生活史復雜，涉及眾多野生動物和家畜，加上早期診斷、藥物治療和外科手術在技術上的挑戰，預防棘球蚴感染成為棘球蚴病防控的重要措施之一。自1995年世界衛生組織（World Health Organization，WHO）成立棘球蚴病非正式工作小組以來，各個國家和地區一直在積極探討預防和控制的措施 [7]。WHO還將棘球蚴病列為被忽視的熱帶病并設立了該疾病的消除目標 [18-20]。目前主要以“切斷傳播鏈和控制傳染源”為核心，實施家犬驅蟲、屠宰管制、家畜免疫預防等措施 [21]，這些防控措施雖然在一定程度上減少了棘球蚴病的傳播和流行，但耗費大量人力、物力和財力，且效果有限 [22]。多房棘球絳蟲除“野生動物—家畜”傳播鏈外，還存在“野生動物―野生動物”野外傳播鏈，僅在野外就可完成完整的生活史。散布于野外的蟲卵對低溫、干燥、化學藥物的抵抗力強，在2 ℃的水中可以存活2年半以上，不僅能夠被人偶然接觸和誤食，還會導致棘球絳蟲在野生動物之間持續循環和傳播，長時間威脅動物和人的健康 [2]。因此，距離實現徹底消除棘球蚴病這一目標還有一定距離，還需更加有力的干預措施 [19, 23]。
疫苗接種在預防和控制疾病傳播、保護易感人群、控制疫情、消滅和根除疾病方面發揮了重要作用，是最為安全、經濟和高效的傳染病防控手段[24]。棘球蚴病疫苗研發是徹底消除棘球蚴病的重點攻關課題。自2016年我國實施家畜接種重組Eg95蛋白疫苗預防CE以來，人類棘球蚴病年新增病例顯著下降 [22]。獸用棘球蚴病疫苗在減輕人棘球蚴病負擔和減少畜牧業經濟損失中發揮了作用，為開發人用棘球蚴病疫苗和徹底消除棘球蚴病帶來啟示和希望，也在實踐中證明了預防接種能夠在機體建立長期和穩定的免疫屏障、減少棘球蚴感染和控制病情。過去的研究數據 [22, 25]表明，獸用重組Eg95蛋白疫苗雖能顯著減少棘球蚴囊腫數量和減輕棘球蚴囊腫重量，但并不能完全阻止棘球蚴病的感染和傳播。進一步提高獸用疫苗保護效率，開發人用棘球蚴病疫苗才能為徹底消除棘球蚴病提供有效的手段 [26]。
近年來，有大量的棘球蚴病候選疫苗被開發和報道。根據疫苗的發展階段和組成，主要分為以下幾類：早期棘球蚴病疫苗、重組蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗和載體疫苗。隨著疫苗研發的逐步推進，棘球蚴病疫苗在誘導免疫反應的能力方面得到了顯著的改善和提升，并在動物實驗中顯現了更強的免疫保護效果。這些研究為人用疫苗的開發提供了重要的科學依據，展現出在未來消除棘球蚴病中的應用潛力。
2 棘球蚴病疫苗研究進展
2.1 早期的棘球蚴病疫苗研究
2.1.1 BCG（Bacillus Calmette-Guérin）疫苗
早在1978年，Reuben等 [27]探討BCG疫苗接種對棉鼠抵抗多房棘球絳蟲攻擊的影響，是有記錄以來最早的棘球蚴病疫苗探索。BCG疫苗是一種減毒牛型結核分枝桿菌活菌疫苗，用于結核病的免疫預防[28]。該疫苗能夠同時誘導天然免疫反應和結核特異性的過繼免疫反應，對其他細菌、病毒、寄生蟲等非同源病原體感染也具有非特異性的保護作用[29]。Reuben等 [27]發現BCG疫苗在保護多房棘球蚴絳蟲感染中展現了一定的保護潛力，提示免疫預防也是阻斷棘球絳蟲感染的一種途徑。從此，更多的棘球蚴病疫苗研究被逐漸開展。
2.1.2 蟲體源蛋白疫苗
21世紀以來，研究者從蟲體組織提取蛋白以篩選保護性抗原。蟲體源蛋白疫苗是直接從棘球蚴囊液、六鉤蚴和原頭蚴蟲體中提取和純化蛋白制成的疫苗，是早期棘球蚴病疫苗的主要研究對象 [30]（表1）。研究[31-38]結果表明，這些蟲體源蛋白疫苗能夠誘導宿主產生針對棘球絳蟲抗原的特異性免疫反應，達到預防感染的目的。蟲體源蛋白疫苗通常由多種已知和未知蛋白組成，成分復雜。當前來源于多房棘球絳蟲的Em2 [39]（棘球蚴囊腫角質層蛋白）、E/S（原頭蚴蛋白） [31]、SRF1（原頭蚴糖蛋白） [32]的成分較為明確，組成相對單一。蟲體源蛋白在鼠或犬等動物模型中應用具有較好的免疫原性，誘導一定的免疫保護效果。如在接受棘球絳蟲攻擊的AE實驗中，接種SRF1的犬體內蟲量較未接種SRF1的犬減少87.60% [32]，小鼠接種E/S抗原后獲得91.70%的保護效率 [31]。但蟲體源蛋白疫苗在實際應用中仍面臨諸多挑戰。一方面，蟲體源蛋白疫苗組成成分復雜，有效成分不明確，毒副作用風險高，同時其穩定性難以保證；另一方面，生產和純化蟲體源蛋白疫苗過程中的技術復雜且成本高昂，需要大量的設備和專業技術人員；此外，依賴蟲體樣本作為原材料的生產方式面臨供給不穩定的難題，如野外采集蟲體樣本既耗時費力，又存在生物安全隱患。因此，質量控制以及審批和監管方面的挑戰限制了蟲體源蛋白疫苗進一步的發展和應用，早期的BCG疫苗和蟲體源蛋白疫苗并非理想的候選疫苗。
表1
蟲體源蛋白疫苗的相關研究
2.2 重組蛋白疫苗
2.2.1 重組Eg95蛋白疫苗
2.2.1.1 重組Eg95蛋白疫苗的發現與應用
隨著基因工程和重組蛋白表達技術的發展，重組棘球絳蟲蛋白在動物實驗中顯示出了一定的免疫原性和保護效果。研究者們嘗試從多種棘球絳蟲抗原中篩選出具有更強免疫原性和更高保護效率的抗原。其中重組Eg95蛋白就是一種高效的保護性抗原，在動物臨床實驗中顯現出有效的保護效果，并被成功商業化應用（表2）[25, 40-45]。1996年，Lightowlers等[25]從細粒棘球絳蟲六鉤蚴cDNA文庫中篩選出Eg95基因，其編碼的Eg95蛋白具有良好的免疫原性，對細粒棘球絳蟲蟲卵攻擊免疫綿羊具有96%的減囊效率。由于重組Eg95蛋白疫苗優良的安全性和有效性，重組Eg95蛋白疫苗在全球范圍內進行了動物臨床實驗[26]，如澳大利亞的試驗結果[46-47]顯示，綿羊皮下接種與GST標記蛋白融合表達的重組GST-Eg95蛋白后，對蟲卵感染的減囊效率高達96%～100%，棘球蚴囊腫抑制率高達99.3%；我國張壯志等 [48]于2008年開展了重組Eg95蛋白疫苗對新生綿羊作用研究的實驗結果表明，在2次免疫接種后，人工感染的保護率達到82.2%以上。隨后重組Eg95蛋白疫苗在全球多地被推廣和應用，也為開發人用棘球蚴病疫苗帶來啟示。通過比較Eg95蛋白不同區域在誘導羊產生保護性免疫應答的能力差異，Lightowlers等團隊發現重組Eg95蛋白疫苗誘導宿主免疫應答和保護性的抗原表位具有構象性 [49]。對獸用棘球蚴病疫苗免疫保護機制的深入探究，揭示它產生免疫保護的關鍵分子和機制，為指導重組Eg95蛋白疫苗的設計和優化以提升免疫保護效率提供了重要參考和依據。
表2
針對CE的重組Eg95蛋白疫苗在不同受試動物中的應用
2.2.1.2 重組Eg95蛋白疫苗的優化方向
由于重組Eg95蛋白疫苗在前期研究和應用中展現出的減囊效果，重組Eg95蛋白疫苗的改進和優化是當前備受關注的研究方向之一。現有上市重組Eg95蛋白疫苗是由大腸桿菌表達系統生產的GST-Eg95融合重組蛋白。GST-Eg95表達產物是不可溶的包涵體，需要經過繁瑣的復性步驟才能重建Eg95蛋白構象，這樣的表達和復性過程增加了重組蛋白制備工藝的難度和成本，制約了疫苗的產能。張藝琳[50]利用結構生物學和生物信息學技術分析了Eg95 DNA和蛋白氨基酸序列，通過截除N端信號肽和C端跨膜結構域的編碼序列，構建優化的可溶性Eg95（Eg95s）表達系統，使Eg95 蛋白的主要抗原表位在大腸桿菌表達系統中實現可溶性表達。經皮下接種Eg95s蛋白1周后，小鼠血清中即可檢測到大量的特異性抗體，與重組Eg95蛋白疫苗比較，Eg95s能夠誘導更高水平的抗體且能夠維持更長時間。Jazouli等 [51]也對Eg95蛋白的表達系統進行優化，構建了可溶性Eg95NC表達系統，并取得了更高的純化效率。Eg95NC [25, 40]在綿羊免疫保護實驗中展現出高達100%保護效率，具有巨大的應用潛力，有望在進一步的動物臨床試驗中取得良好的評估效果。重組蛋白疫苗具有安全性高、易于生產、穩定性好等優點，受到廣泛關注。
2.2.2 其他重組蛋白疫苗
除Eg95重組蛋白疫苗外，還有大量棘球絳蟲蛋白分子被報道作為棘球蚴病疫苗的候選抗原，它們在動物實驗中的減囊效率或減蟲效率達到了5.10%～100%（表3）[23, 35, 52-76]。其中，細粒棘球絳蟲抗原EgVac [52]在犬中實現了對細粒棘球蚴成蟲發育100%的抑制；EgM123 [53]在犬中對蟲卵形成的抑制率也高達99.50%。此外，EgP29[54]、Eg14-3-3 [55-56]、EgGST1 [57]等候選疫苗在小鼠和羊模型中也達到95%以上的減囊效果。多房棘球絳蟲抗原如Em14-3-3 [58]、TSP1[59]和Em95 [60-61]達到了75%以上的減囊效果。
表3
重組蛋白疫苗在不同疾病的受試動物中的應用
2.2.3 多價聯合重組蛋白疫苗
棘球絳蟲的感染有多種蛋白質的參與和復雜的機制。寄生蟲在不同發育階段所表達的蛋白質存在質和量的差異。單個抗原的候選疫苗可能難以達到滿意的保護效果。應對這一挑戰，研究者們開始關注棘球絳蟲感染過程中的多個關鍵抗原，并將這些抗原融合表達，設計出多價聯用疫苗，如EgFABP-EgA31通用絳蟲疫苗。EgFABP [77-78]基因能夠從原頭蚴cDNA中克隆，對應一類參與脂肪酸交換和運輸的功能蛋白質；EgA31 [79]由細粒棘球絳蟲成蟲cDNA表達文庫中篩選出，表達于原頭蚴吸盤區域的皮層細胞。當原頭蚴頭節外翻時，吸盤上的EgA31 mRNA含量顯著增加，具有良好的免疫原性，能誘導犬產生特異性抗體，也能被棘球蚴患者血清所識別 [80-81]。這些多價聯用疫苗的設計覆蓋多個靶點，能夠增強疫苗的免疫保護效果。這一策略為棘球蚴病疫苗的研發提供了新的方向和可能性。
2.3 核酸疫苗
2.3.1 DNA疫苗
DNA疫苗是21世紀新興的一種疫苗類型，在棘球蚴病疫苗的研究中備受關注。DNA疫苗的關鍵成分是一小段環狀DNA，其中包含編碼特定疫苗抗原的基因。接種入機體的DNA借助宿主細胞表達抗原表位，這些抗原表位會被呈遞到宿主細胞表面，觸發針對疫苗抗原的免疫應答 [82]。目前報道有Eg95 [83]、EgAgB8/2 [84]、EgP29 [85]和EgAgB [86]基因的DNA疫苗 [87-88]。與CE DNA相關研究約5項，其中僅EgP29和EgA31有保護性的評價，其減囊效率為50%～93%（表4）。盡管現有DNA疫苗的免疫原性較弱，但這類疫苗能激活CD4+和CD8+ T細胞，誘導體液和細胞免疫反應，這使得DNA疫苗在誘導免疫反應方面仍具有獨特優勢；它還具有高度的熱穩定性，無需低溫保存和冷鏈運輸，儲存和運輸的成本低 [89]。因此，DNA疫苗在全球范圍，尤其是在資源有限的發展中國家，具有極大的吸引力。DNA疫苗的優勢為棘球蚴病疫苗的研發提供了新的方向，但針對棘球蚴病的DNA疫苗研究仍處于初級階段 [85, 90]。DNA疫苗的有效性和安全性需要通過更多的臨床試驗來驗證。例如，疫苗DNA片段在宿主體內的持續存在和整合到宿主基因組帶來的安全性擔憂。其次，DNA疫苗的設計還需要進一步優化，并開發高效的佐劑，以提高它在宿主中的表達效率和免疫原性 [89]。目前尚無針對AE的DNA疫苗研究報道，這為研究提供了廣闊的探索空間。
表4
核酸DNA疫苗的應用
2.3.2 mRNA疫苗
除了DNA疫苗，近年來備受關注的mRNA疫苗也在疾病的防控中展現出了巨大的潛力。mRNA疫苗利用接種者細胞合成棘球絳蟲抗原來激發機體的免疫反應，其獨特的優勢主要體現在以下幾個方面：① mRNA疫苗制備不涉及感染性的病原體，避免了感染和致病的風險；② 通過引入轉錄后修飾，mRNA疫苗的有效性和穩定性高；③ 具備快速研發、擴大規模和快速生產的優勢 [92-93]；④ mRNA疫苗具有良好的穩定性，如進入臨床試驗的mRNA狂犬疫苗CV7201可以于5～25 ℃環境下儲存3年 [94-95]。因此，mRNA疫苗的安全性、快速性、穩定性、適應性等優勢為棘球蚴病的防控提供了新的希望和選擇。然而在棘球蚴病mRNA疫苗的研發尚處于啟動中，其有效性、安全性、生產工藝、生產成本和市場價值需進一步評估和優化。
2.4 合成表位疫苗
借助于計算機模擬、數據分析，以及成熟的基因重組和高效表達的系統技術，反向設計和開發具有高免疫原性和高安全性的抗原疫苗也是當前疫苗研究的方向。
生物信息學的方法和技術被應用于抗原結構和理化參數的分析，預測T細胞和B細胞抗原表位。經過針對性地設計和改造蛋白質結構，能編碼多個免疫優勢表位，從而更精確地誘導持久的免疫應答，增強抗原誘導的免疫保護效果 [72]。如通過預測Eg95蛋白的T細胞和B細胞表位設計出了多表位抗原多肽，這一多表位抗原多肽與白細胞介素（interleukin，IL）-2組合，在小鼠體內誘導出與商用重組Eg95蛋白疫苗相當水平的體液免疫和更強的細胞免疫應答，表現在相當水平的Eg95特異性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgA、IgM抗體和較高水平的輔助T細胞1型（IL-2、IL-12p70、腫瘤壞死因子α和干擾素-γ）和輔助T細胞2型（IL-4、IL-5、IL-6和IL-13）細胞因子[83]。Yu等 [96]通過對蛋白質的理化參數、跨膜結構域、信號肽、磷酸化位點、二級結構、三級結構和T、B細胞表位的預測，利用分子對接技術優化細胞表位，構建了EgTeg和EgFABP1的多表位疫苗，這種多表位疫苗在小鼠實驗中表現出良好的免疫原性，能顯著減輕原頭蚴腹腔注射感染小鼠的棘球蚴囊腫重量。此外，Eg14-3-3 [52]、EgP29 [97]、EgM9、Eg10196、EgA31、EgG1Y162 [98-99]等抗原也被用于預測T細胞和B細胞表位，但目前缺乏免疫原性和免疫保護效果評估的相關數據以支撐其應用的可行性。
計算機輔助設計可以開發具有高免疫原性和高安全性的疫苗，它能夠為棘球蚴病防控提供新的策略和方法。但不同的軟件可能使用不同的算法和數據源，導致表位預測結果的差異。因此，為了提高表位預測的準確性，使用多個軟件同時進行預測并綜合考慮預測結果是必要的。
2.5 載體疫苗
載體疫苗是一類利用DNA重組技術，通過細菌、真菌、病毒或納米顆粒等載體將目標抗原基因或蛋白傳遞到機體免疫系統，誘導特異性免疫應答的疫苗。常見的載體有酵母、病毒、細菌、納米顆粒等。目前已被文獻報道的棘球蚴病疫苗載體包括：精氨酸納米脂質顆粒 [83]、納米細胞膜囊泡 [100]、牛痘病毒 [101]、沙門氏菌 [102]、BCG [103]、乳酸乳球菌 [104]、雙歧桿菌 [105]、狂犬病毒 [106]等。細菌載體疫苗研究占比最多，但僅有少數研究評估了疫苗的免疫保護效率（表5） [64, 101, 103, 107-110]，其中以BCG為載體的疫苗對棘球蚴囊腫的抑制率最高（為92.46%） [103]。除了細菌載體疫苗，以納米細胞膜囊泡為載體的T細胞和B細胞多表位疫苗（V-T/B） [100]首次展示了一種可以減輕多房棘球絳蟲負擔的納米疫苗策略，該疫苗在小鼠實驗中能夠激活樹突狀細胞，并誘導特異性T/B細胞互饋回路，充分發揮細胞免疫和體液免疫在抵抗感染中的作用，最終顯著抑制多房棘球蚴感染和棘球蚴囊腫生長。此外，這些載體疫苗的傳遞方式豐富多樣，涵蓋皮下接種、肌肉接種、呼吸道接種和消化道接種。經呼吸道和消化道接種為家畜和動物免疫提供了便捷的防疫方式，是這類疫苗的優勢。未來載體疫苗在棘球蚴病防控中的應用前景廣闊，但仍需要在安全性、穩定性、免疫原性等方面開展更多研究，需要進一步的臨床試驗數據支撐以促進其轉化和應用。
表5
細菌載體疫苗的應用
3 疫苗研發面臨的主要瓶頸和挑戰
3.1 致病和抵抗機制認知不足
目前，已了解棘球絳蟲入侵和感染的途徑及基本過程，但對棘球絳蟲感染的致病機制和機體免疫防疫機制缺乏全面和系統的認識，特別是對寄生蟲入侵和感染過程中在分子層面的認識，例如，尚不清楚參與棘球絳蟲感染和在宿主體內發育過程中的關鍵分子及其生物學功能。深入探究宿主與棘球絳蟲間相互作用的具體分子機制和免疫反應，將為優化和設計疫苗提供更多的線索和靶點。可以依托合適的動物感染模型，加強對六鉤蚴入侵中間宿主及它在體內生長發育過程中的分子機制和免疫應答的研究，探尋棘球絳蟲感染過程中直接和協助參與入侵宿主的關鍵抗原和靶點，以及棘球絳蟲入侵宿主的關鍵環節。
3.2 實驗用感染性材料的限制
感染動物模型是疫苗研發中不可或缺的環節，缺乏足夠的感染性材料是棘球蚴病感染機制研究和疫苗開發中的挑戰之一。棘球絳蟲主要分布在畜牧業發達的牧區或半牧區，例如，細粒棘球絳蟲的幼蟲階段主要寄生于偶蹄類動物，而成蟲則寄生于犬科動物 [111]。這種生物學限制使得在實驗室條件下持續獲取、長期保存和人工擴增棘球絳蟲在資源獲取和技術上都面臨諸多困難，導致實驗依賴野外人工采集蟲體樣本。因此，加強國內和國際的合作，共享實驗材料、技術平臺及研究成果，減少重復性工作，將加速疫苗候選物的篩選與評估。鑒于獲取感染性材料的困難，還可以考慮開發替代感染模型，如利用細胞系或模式動物模擬棘球絳蟲感染過程。
3.3 有效性評價方式和指標的差異
棘球蚴病疫苗的研發面臨多方面的瓶頸和挑戰。無論是蟲體源蛋白疫苗、重組蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗還是載體疫苗，都面臨如何找到具有更強免疫原性和更好免疫保護效果的抗原問題。比較各種抗原的免疫保護機制和效果有助于加速篩選出最優的疫苗抗原。但由于不同研究之間的接種方式、疫苗佐劑的選擇、動物模型和攻毒方式、以及保護性評價指標存在差異，難以在臨床前階段通過文獻報道的結果直接比較和評價不同候選疫苗間的保護效果。
3.3.1 接種方式與疫苗的保護效果
大多數研究通過皮下注射接種疫苗，而TSP3蛋白 [78]經呼吸道和皮下注射接種小鼠誘導的減囊效率分別為62.8%和81.9%，提示同種抗原采用不同的接種方式所誘導的免疫保護效果存在差異，表明探究疫苗的投遞方式可能有助于進一步提升疫苗的免疫保護效果。近年來有文獻 [112]報道，口服接種疫苗不僅可以誘導系統性的免疫應答，還可以增強消化道局部黏膜免疫應答，具有多重保護優勢。如口服疫苗可以提高患者的依從性，降低注射帶來的風險，簡化給藥過程，減少對醫護人員的需求，以及降低職業暴露導致的傷害等 [113]。鑒于棘球蚴病“病從口入”及六鉤蚴穿透腸黏膜的感染特點，口服接種疫苗和增強局部黏膜免疫反應，從理論上是一種有效的預防棘球蚴感染的方法。
3.3.2 佐劑選擇與疫苗的保護效果
佐劑也是影響疫苗保護效果的重要因素之一。Heath等 [114]使用不同佐劑組合，比較了重組Eg95蛋白疫苗的保護效果，其中包括單獨使用Eg95以及與TASGEL、SAPONIN、ISA70、M888_Drakeol、DEAE_Dextran、QuilA、ISA50、STM等佐劑搭配，結果顯示，Eg95單獨使用時的保護有效率為34%～87%，與上述佐劑分別組合后的保護有效率分別為38%～68%、93%～100%、95%～100%、–10%～95%、64%～100%、86%～100%、63%～99%和70%～100%，結果提示，佐劑的合理選擇和搭配可以提升疫苗的免疫保護效果，對進一步探討不同佐劑組合的優化策略提供了有力的依據。
3.3.3 動物模型與疫苗效果評價
不同動物模型與攻毒方式的差異限制了不同抗原的免疫原性和保護效果的直接比較。在棘球蚴病疫苗的保護效果評價中，攻毒方式主要包括口服蟲卵和腹腔注射原頭蚴兩種感染模型，這兩種攻毒模型的存在導致不同研究中不同抗原的免疫保護效果難以直接比較。六鉤蚴穿透腸壁進入機體是自然感染發生的關鍵環節，而腹腔注射原頭蚴感染小鼠動物模型僅模擬了原頭蚴在宿主腹腔內定植和發育成為囊腫的發病過程 [111]。相比之下，建立經消化道蟲卵自然感染的動物模型是評價疫苗保護效率的必要工具，在模擬感染過程和評估疫苗的有效性方面具有獨特的優勢。Dempster等 [115]報道DBA/2J小鼠經消化道感染Eg蟲卵的有效率約為83.3%；由弘等 [116]報道昆明鼠口服Eg蟲卵的感染有效率為81%。近年的棘球蚴病疫苗研發中腹腔注射原頭蚴感染小鼠的模型約占44%，是評估疫苗保護效率的重要工具。為了更客觀地評價疫苗的免疫保護效果，在疫苗研究中有必要選擇和統一最接近自然感染的攻毒方式。
3.3.4 保護性評價指標
當前的疫苗研究缺乏統一的保護性評價指標。雖然大量重組蛋白疫苗研究已取得一定進展，但保護性評價的指標各異。如棘球蚴囊腫重量減輕率、棘球蚴囊腫數量減少率、成蟲降低率、蟲卵降低率、保護效率等都用作保護性評價的指標，導致各研究間評估結果的差異化和可比性差，阻礙了棘球蚴病保護性抗原有效性的直接評估和比較。因此，為了確保研究結果的可靠性和可比性，迫切需要在棘球蚴病疫苗研究領域建立統一的評估指標和標準化的實驗方法，以便更有效地評估和比較不同實驗室間的抗原保護效果，從而推動棘球蚴病疫苗的研發和應用進程。
3.4 野生動物的免疫預防
僅依靠對家畜免疫接種的措施不能解決物種間反復傳播這一問題和消除環境中分布的蟲卵，因此，預防野生動物感染也是控制和徹底消除棘球蚴病不可忽略的環節。但傳統的動物接種方法無法直接復制和應用于野生動物。“可傳播疫苗” [117]是一種載有來自病原體基因片段的動物病毒，具有個體間傳播能力，通過接觸感染在野生動物種群中傳播，以誘導種群免疫反應，可能是打破棘球蚴病野外傳播鏈的理想工具。2001年，為預防兔黏液瘤病，Torres等 [118]研制表達兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白的重組黏液瘤病毒活疫苗，在小島上為少數野兔接種疫苗后，小島上50%未接種疫苗的野兔也產生了抗原特異性抗體。提示可傳播疫苗在預防人畜共患病方面存在巨大潛力。
4 總結及未來展望
過去幾十年來，中國針對人類、牲畜和家犬的棘球蚴病防控工作取得了重要進展。在教育宣傳、家畜屠宰管理、犬只管理、強制免疫、疫情監控等防控策略的實施下，2022年全國新增病例數量較2004年約下降了50% [22]。然而最新的熱帶病報告 [19]顯示，全球每年仍有31個國家報告了棘球蚴病病例，棘球蚴病仍然為全人類健康帶來了巨大的威脅和造成了嚴重的經濟負擔 [119-120]，完全消除棘球蚴病尚需全人類的共同和繼續努力。
疫苗作為控制傳染病的最有效和最經濟的手段，其研發是一項極具挑戰性的任務。盡管當前已有針對細粒棘球絳蟲的獸用疫苗，但該疫苗的設計有待優化，免疫保護效果有待提升。構建的很多候選疫苗尚無充分的免疫保護性評價，約23%的棘球蚴病疫苗研究僅停留在實驗室階段，多數候選疫苗有待臨床試驗的評價，以促進其進一步推廣和應用。若能克服棘球蚴病疫苗研發過程中面臨的諸多挑戰，必定會加速疫苗的研發和棘球蚴病防控的進程。
總之，棘球蚴病的防控雖然面臨致病和抵抗機制、疫苗研發技術、野生動物傳播等諸多挑戰，但通過對疾病感染和免疫防疫機制的深入研究以及創新技術的運用，有望開發出更多安全有效的棘球蚴病疫苗，以控制棘球蚴病的流行。特別是對于經濟欠發達的地區，棘球蚴病防控帶來的收益遠不止保障當地農牧民的健康，還能幫助當地農牧民實現生計改善，完成“全國所有流行縣基本控制棘球蚴病流行”和“健康中國2030”的目標和任務，真正實現在全球消滅棘球蚴病。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：顧焓霏查詢文獻、整理數據和撰寫論文初稿；牟軍查詢文獻與整理數據；劉杰整體規劃與監管及審閱與修訂論文。
棘球蚴病（又稱“包蟲病”）是一種由棘球絳蟲感染引起的人畜共患寄生蟲病，主要分為囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）和泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）兩種類型[1]。人因誤食細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus，Eg）或多房棘球絳蟲（Echinococcus multilocularis，Em）蟲卵而分別感染這兩種疾病 [1]。誤攝入蟲卵內的六鉤蚴在消化道內被孵化和激活，穿透腸黏膜屏障，通過血液（主要）和淋巴循環到達和定植于組織或器官[2]，其中70%定植于肝臟 [3-4]。人感染棘球絳蟲后，CE在寄生器官內早期主要表現為肉芽腫，隨著肉芽腫的生長，外層纖維囊壁不斷纖維化增生，最終形成纖維結締組織包被的囊腫；AE囊腫在寄生器官內浸潤式生長，不斷增殖產生新囊泡并深入組織，還可以通過淋巴管道和血管轉移到遠端組織，類似腫瘤的浸潤和擴散[5]。棘球蚴囊腫破裂可引起過敏反應，甚至休克，因囊腫破裂后外漏的原頭蚴隨囊液流入破裂口周圍而形成繼發性棘球蚴囊腫 [6]。
全球估計有超過100萬人受到棘球蚴病的影響，而僅CE相關的治療費用及畜牧業損失每年高達30億美元 [7]。在阿根廷、秘魯、東非、中亞、中國等地區或國家，CE患病率高達5%～10% [8]。在中國2012–2016年棘球蚴病流行病學調查中，全國共有368個棘球蚴病流行縣，人群患病率為0.28%，患病達166 098例 [9]。其中石渠縣是流行較為嚴重的地區之一，2017年AE患病率高達8.72% [10]。切斷傳染源和改善衛生條件是當前全球公認的主要防控手段。但由于流行地區自然和社會環境復雜，棘球蚴病的防控仍面臨嚴峻挑戰。目前獸用CE疫苗（重組Eg95蛋白）在家畜中取得了較好的減囊效果，在一定程度上減緩了棘球蚴病的傳播和流行，也為人用棘球蚴病疫苗的研發奠定了理論基礎。為了加快獸用棘球蚴病疫苗的優化和促進人用棘球蚴病疫苗的研發，現對目前國內外棘球蚴病疫苗的最新研究進展進行歸納總結，探討棘球蚴病疫苗研發過程中面臨的挑戰與解決方案，為棘球蚴病的疫苗研發提供理論支持和實踐指導。
1 棘球蚴病疫苗開發的背景
近年來，棘球蚴病的診療水平有了逐步提高，治療方式包括手術切除、藥物聯合治療（苯并咪唑類化合物）和對癥治療 [11]。根據國內外學者共識，為最大限度地根治疾病、延長患者壽命及提高患者生命質量，CE以手術治療為主，藥物治療為輔；AE的治療包括手術、介入及藥物聯合治療 [5]。然而治療后的復發率較高，其中CE的復發率約為6.5% [7]，AE的復發率為2%～5% [12]。若未治療、治療不及時或治療不當，CE患者10～15年病死率高達90% [13]。由于手術切除的復雜性和藥物治療的長期性，棘球蚴病的治療費用昂貴，在治療和管理方面均面臨巨大挑戰 [8]。因此，預防及早期診斷對于棘球蚴病的治療、減輕病情和減少并發癥具有重要意義。
棘球蚴病的臨床診斷主要依據患者的流行病學史、臨床表現、影像學檢查及實驗室檢查包括病原學檢查的綜合應用。其中，影像學檢查是棘球蚴病診斷的重要手段 [13]。但由于棘球蚴囊腫在人體內生長緩慢，早期較為隱匿，隨病灶長大才顯現出器官和鄰近組織擠壓相關的臨床癥狀，患者就醫晚或在體檢中偶然發現 [11, 14]。以免疫學為基礎的棘球蚴病快速診斷試劑盒不僅廣泛應用于流行病學篩查，也作為確認影像檢查結果的手段用于棘球蚴病的診斷和鑒別診斷，但當前血清學檢測的靈敏性和特異性尚待提高。中國食品藥品監督管理總局批準上市和使用的3種臨床輔助診斷抗體檢測試劑（新疆貝斯明、上海新吉而和珠海海泰）的靈敏度為90.8%～94.3%、特異性為75.7%～83.3% [15]。經手術確認的CE患者的血清學檢測的靈敏度和特異性均約為60%～90% [13]。AE的血清學診斷可靠性較高，以Em2為抗原的ELISA檢測靈敏度和特異性均可達90% [14]；此外，與其他寄生蟲的交叉反應性限制了免疫學檢測方法的準確度 [16-17]。因此，棘球蚴病免疫學診斷在特異性、敏感性和交叉反應性方面還面臨挑戰，診斷結果有待綜合考慮和評估。
棘球絳蟲的生活史復雜，涉及眾多野生動物和家畜，加上早期診斷、藥物治療和外科手術在技術上的挑戰，預防棘球蚴感染成為棘球蚴病防控的重要措施之一。自1995年世界衛生組織（World Health Organization，WHO）成立棘球蚴病非正式工作小組以來，各個國家和地區一直在積極探討預防和控制的措施 [7]。WHO還將棘球蚴病列為被忽視的熱帶病并設立了該疾病的消除目標 [18-20]。目前主要以“切斷傳播鏈和控制傳染源”為核心，實施家犬驅蟲、屠宰管制、家畜免疫預防等措施 [21]，這些防控措施雖然在一定程度上減少了棘球蚴病的傳播和流行，但耗費大量人力、物力和財力，且效果有限 [22]。多房棘球絳蟲除“野生動物—家畜”傳播鏈外，還存在“野生動物―野生動物”野外傳播鏈，僅在野外就可完成完整的生活史。散布于野外的蟲卵對低溫、干燥、化學藥物的抵抗力強，在2 ℃的水中可以存活2年半以上，不僅能夠被人偶然接觸和誤食，還會導致棘球絳蟲在野生動物之間持續循環和傳播，長時間威脅動物和人的健康 [2]。因此，距離實現徹底消除棘球蚴病這一目標還有一定距離，還需更加有力的干預措施 [19, 23]。
疫苗接種在預防和控制疾病傳播、保護易感人群、控制疫情、消滅和根除疾病方面發揮了重要作用，是最為安全、經濟和高效的傳染病防控手段[24]。棘球蚴病疫苗研發是徹底消除棘球蚴病的重點攻關課題。自2016年我國實施家畜接種重組Eg95蛋白疫苗預防CE以來，人類棘球蚴病年新增病例顯著下降 [22]。獸用棘球蚴病疫苗在減輕人棘球蚴病負擔和減少畜牧業經濟損失中發揮了作用，為開發人用棘球蚴病疫苗和徹底消除棘球蚴病帶來啟示和希望，也在實踐中證明了預防接種能夠在機體建立長期和穩定的免疫屏障、減少棘球蚴感染和控制病情。過去的研究數據 [22, 25]表明，獸用重組Eg95蛋白疫苗雖能顯著減少棘球蚴囊腫數量和減輕棘球蚴囊腫重量，但并不能完全阻止棘球蚴病的感染和傳播。進一步提高獸用疫苗保護效率，開發人用棘球蚴病疫苗才能為徹底消除棘球蚴病提供有效的手段 [26]。
近年來，有大量的棘球蚴病候選疫苗被開發和報道。根據疫苗的發展階段和組成，主要分為以下幾類：早期棘球蚴病疫苗、重組蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗和載體疫苗。隨著疫苗研發的逐步推進，棘球蚴病疫苗在誘導免疫反應的能力方面得到了顯著的改善和提升，并在動物實驗中顯現了更強的免疫保護效果。這些研究為人用疫苗的開發提供了重要的科學依據，展現出在未來消除棘球蚴病中的應用潛力。
2 棘球蚴病疫苗研究進展
2.1 早期的棘球蚴病疫苗研究
2.1.1 BCG（Bacillus Calmette-Guérin）疫苗
早在1978年，Reuben等 [27]探討BCG疫苗接種對棉鼠抵抗多房棘球絳蟲攻擊的影響，是有記錄以來最早的棘球蚴病疫苗探索。BCG疫苗是一種減毒牛型結核分枝桿菌活菌疫苗，用于結核病的免疫預防[28]。該疫苗能夠同時誘導天然免疫反應和結核特異性的過繼免疫反應，對其他細菌、病毒、寄生蟲等非同源病原體感染也具有非特異性的保護作用[29]。Reuben等 [27]發現BCG疫苗在保護多房棘球蚴絳蟲感染中展現了一定的保護潛力，提示免疫預防也是阻斷棘球絳蟲感染的一種途徑。從此，更多的棘球蚴病疫苗研究被逐漸開展。
2.1.2 蟲體源蛋白疫苗
21世紀以來，研究者從蟲體組織提取蛋白以篩選保護性抗原。蟲體源蛋白疫苗是直接從棘球蚴囊液、六鉤蚴和原頭蚴蟲體中提取和純化蛋白制成的疫苗，是早期棘球蚴病疫苗的主要研究對象 [30]（表1）。研究[31-38]結果表明，這些蟲體源蛋白疫苗能夠誘導宿主產生針對棘球絳蟲抗原的特異性免疫反應，達到預防感染的目的。蟲體源蛋白疫苗通常由多種已知和未知蛋白組成，成分復雜。當前來源于多房棘球絳蟲的Em2 [39]（棘球蚴囊腫角質層蛋白）、E/S（原頭蚴蛋白） [31]、SRF1（原頭蚴糖蛋白） [32]的成分較為明確，組成相對單一。蟲體源蛋白在鼠或犬等動物模型中應用具有較好的免疫原性，誘導一定的免疫保護效果。如在接受棘球絳蟲攻擊的AE實驗中，接種SRF1的犬體內蟲量較未接種SRF1的犬減少87.60% [32]，小鼠接種E/S抗原后獲得91.70%的保護效率 [31]。但蟲體源蛋白疫苗在實際應用中仍面臨諸多挑戰。一方面，蟲體源蛋白疫苗組成成分復雜，有效成分不明確，毒副作用風險高，同時其穩定性難以保證；另一方面，生產和純化蟲體源蛋白疫苗過程中的技術復雜且成本高昂，需要大量的設備和專業技術人員；此外，依賴蟲體樣本作為原材料的生產方式面臨供給不穩定的難題，如野外采集蟲體樣本既耗時費力，又存在生物安全隱患。因此，質量控制以及審批和監管方面的挑戰限制了蟲體源蛋白疫苗進一步的發展和應用，早期的BCG疫苗和蟲體源蛋白疫苗并非理想的候選疫苗。
表1
蟲體源蛋白疫苗的相關研究
2.2 重組蛋白疫苗
2.2.1 重組Eg95蛋白疫苗
2.2.1.1 重組Eg95蛋白疫苗的發現與應用
隨著基因工程和重組蛋白表達技術的發展，重組棘球絳蟲蛋白在動物實驗中顯示出了一定的免疫原性和保護效果。研究者們嘗試從多種棘球絳蟲抗原中篩選出具有更強免疫原性和更高保護效率的抗原。其中重組Eg95蛋白就是一種高效的保護性抗原，在動物臨床實驗中顯現出有效的保護效果，并被成功商業化應用（表2）[25, 40-45]。1996年，Lightowlers等[25]從細粒棘球絳蟲六鉤蚴cDNA文庫中篩選出Eg95基因，其編碼的Eg95蛋白具有良好的免疫原性，對細粒棘球絳蟲蟲卵攻擊免疫綿羊具有96%的減囊效率。由于重組Eg95蛋白疫苗優良的安全性和有效性，重組Eg95蛋白疫苗在全球范圍內進行了動物臨床實驗[26]，如澳大利亞的試驗結果[46-47]顯示，綿羊皮下接種與GST標記蛋白融合表達的重組GST-Eg95蛋白后，對蟲卵感染的減囊效率高達96%～100%，棘球蚴囊腫抑制率高達99.3%；我國張壯志等 [48]于2008年開展了重組Eg95蛋白疫苗對新生綿羊作用研究的實驗結果表明，在2次免疫接種后，人工感染的保護率達到82.2%以上。隨后重組Eg95蛋白疫苗在全球多地被推廣和應用，也為開發人用棘球蚴病疫苗帶來啟示。通過比較Eg95蛋白不同區域在誘導羊產生保護性免疫應答的能力差異，Lightowlers等團隊發現重組Eg95蛋白疫苗誘導宿主免疫應答和保護性的抗原表位具有構象性 [49]。對獸用棘球蚴病疫苗免疫保護機制的深入探究，揭示它產生免疫保護的關鍵分子和機制，為指導重組Eg95蛋白疫苗的設計和優化以提升免疫保護效率提供了重要參考和依據。
表2
針對CE的重組Eg95蛋白疫苗在不同受試動物中的應用
2.2.1.2 重組Eg95蛋白疫苗的優化方向
由于重組Eg95蛋白疫苗在前期研究和應用中展現出的減囊效果，重組Eg95蛋白疫苗的改進和優化是當前備受關注的研究方向之一。現有上市重組Eg95蛋白疫苗是由大腸桿菌表達系統生產的GST-Eg95融合重組蛋白。GST-Eg95表達產物是不可溶的包涵體，需要經過繁瑣的復性步驟才能重建Eg95蛋白構象，這樣的表達和復性過程增加了重組蛋白制備工藝的難度和成本，制約了疫苗的產能。張藝琳[50]利用結構生物學和生物信息學技術分析了Eg95 DNA和蛋白氨基酸序列，通過截除N端信號肽和C端跨膜結構域的編碼序列，構建優化的可溶性Eg95（Eg95s）表達系統，使Eg95 蛋白的主要抗原表位在大腸桿菌表達系統中實現可溶性表達。經皮下接種Eg95s蛋白1周后，小鼠血清中即可檢測到大量的特異性抗體，與重組Eg95蛋白疫苗比較，Eg95s能夠誘導更高水平的抗體且能夠維持更長時間。Jazouli等 [51]也對Eg95蛋白的表達系統進行優化，構建了可溶性Eg95NC表達系統，并取得了更高的純化效率。Eg95NC [25, 40]在綿羊免疫保護實驗中展現出高達100%保護效率，具有巨大的應用潛力，有望在進一步的動物臨床試驗中取得良好的評估效果。重組蛋白疫苗具有安全性高、易于生產、穩定性好等優點，受到廣泛關注。
2.2.2 其他重組蛋白疫苗
除Eg95重組蛋白疫苗外，還有大量棘球絳蟲蛋白分子被報道作為棘球蚴病疫苗的候選抗原，它們在動物實驗中的減囊效率或減蟲效率達到了5.10%～100%（表3）[23, 35, 52-76]。其中，細粒棘球絳蟲抗原EgVac [52]在犬中實現了對細粒棘球蚴成蟲發育100%的抑制；EgM123 [53]在犬中對蟲卵形成的抑制率也高達99.50%。此外，EgP29[54]、Eg14-3-3 [55-56]、EgGST1 [57]等候選疫苗在小鼠和羊模型中也達到95%以上的減囊效果。多房棘球絳蟲抗原如Em14-3-3 [58]、TSP1[59]和Em95 [60-61]達到了75%以上的減囊效果。
表3
重組蛋白疫苗在不同疾病的受試動物中的應用
2.2.3 多價聯合重組蛋白疫苗
棘球絳蟲的感染有多種蛋白質的參與和復雜的機制。寄生蟲在不同發育階段所表達的蛋白質存在質和量的差異。單個抗原的候選疫苗可能難以達到滿意的保護效果。應對這一挑戰，研究者們開始關注棘球絳蟲感染過程中的多個關鍵抗原，并將這些抗原融合表達，設計出多價聯用疫苗，如EgFABP-EgA31通用絳蟲疫苗。EgFABP [77-78]基因能夠從原頭蚴cDNA中克隆，對應一類參與脂肪酸交換和運輸的功能蛋白質；EgA31 [79]由細粒棘球絳蟲成蟲cDNA表達文庫中篩選出，表達于原頭蚴吸盤區域的皮層細胞。當原頭蚴頭節外翻時，吸盤上的EgA31 mRNA含量顯著增加，具有良好的免疫原性，能誘導犬產生特異性抗體，也能被棘球蚴患者血清所識別 [80-81]。這些多價聯用疫苗的設計覆蓋多個靶點，能夠增強疫苗的免疫保護效果。這一策略為棘球蚴病疫苗的研發提供了新的方向和可能性。
2.3 核酸疫苗
2.3.1 DNA疫苗
DNA疫苗是21世紀新興的一種疫苗類型，在棘球蚴病疫苗的研究中備受關注。DNA疫苗的關鍵成分是一小段環狀DNA，其中包含編碼特定疫苗抗原的基因。接種入機體的DNA借助宿主細胞表達抗原表位，這些抗原表位會被呈遞到宿主細胞表面，觸發針對疫苗抗原的免疫應答 [82]。目前報道有Eg95 [83]、EgAgB8/2 [84]、EgP29 [85]和EgAgB [86]基因的DNA疫苗 [87-88]。與CE DNA相關研究約5項，其中僅EgP29和EgA31有保護性的評價，其減囊效率為50%～93%（表4）。盡管現有DNA疫苗的免疫原性較弱，但這類疫苗能激活CD4+和CD8+ T細胞，誘導體液和細胞免疫反應，這使得DNA疫苗在誘導免疫反應方面仍具有獨特優勢；它還具有高度的熱穩定性，無需低溫保存和冷鏈運輸，儲存和運輸的成本低 [89]。因此，DNA疫苗在全球范圍，尤其是在資源有限的發展中國家，具有極大的吸引力。DNA疫苗的優勢為棘球蚴病疫苗的研發提供了新的方向，但針對棘球蚴病的DNA疫苗研究仍處于初級階段 [85, 90]。DNA疫苗的有效性和安全性需要通過更多的臨床試驗來驗證。例如，疫苗DNA片段在宿主體內的持續存在和整合到宿主基因組帶來的安全性擔憂。其次，DNA疫苗的設計還需要進一步優化，并開發高效的佐劑，以提高它在宿主中的表達效率和免疫原性 [89]。目前尚無針對AE的DNA疫苗研究報道，這為研究提供了廣闊的探索空間。
表4
核酸DNA疫苗的應用
2.3.2 mRNA疫苗
除了DNA疫苗，近年來備受關注的mRNA疫苗也在疾病的防控中展現出了巨大的潛力。mRNA疫苗利用接種者細胞合成棘球絳蟲抗原來激發機體的免疫反應，其獨特的優勢主要體現在以下幾個方面：① mRNA疫苗制備不涉及感染性的病原體，避免了感染和致病的風險；② 通過引入轉錄后修飾，mRNA疫苗的有效性和穩定性高；③ 具備快速研發、擴大規模和快速生產的優勢 [92-93]；④ mRNA疫苗具有良好的穩定性，如進入臨床試驗的mRNA狂犬疫苗CV7201可以于5～25 ℃環境下儲存3年 [94-95]。因此，mRNA疫苗的安全性、快速性、穩定性、適應性等優勢為棘球蚴病的防控提供了新的希望和選擇。然而在棘球蚴病mRNA疫苗的研發尚處于啟動中，其有效性、安全性、生產工藝、生產成本和市場價值需進一步評估和優化。
2.4 合成表位疫苗
借助于計算機模擬、數據分析，以及成熟的基因重組和高效表達的系統技術，反向設計和開發具有高免疫原性和高安全性的抗原疫苗也是當前疫苗研究的方向。
生物信息學的方法和技術被應用于抗原結構和理化參數的分析，預測T細胞和B細胞抗原表位。經過針對性地設計和改造蛋白質結構，能編碼多個免疫優勢表位，從而更精確地誘導持久的免疫應答，增強抗原誘導的免疫保護效果 [72]。如通過預測Eg95蛋白的T細胞和B細胞表位設計出了多表位抗原多肽，這一多表位抗原多肽與白細胞介素（interleukin，IL）-2組合，在小鼠體內誘導出與商用重組Eg95蛋白疫苗相當水平的體液免疫和更強的細胞免疫應答，表現在相當水平的Eg95特異性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgA、IgM抗體和較高水平的輔助T細胞1型（IL-2、IL-12p70、腫瘤壞死因子α和干擾素-γ）和輔助T細胞2型（IL-4、IL-5、IL-6和IL-13）細胞因子[83]。Yu等 [96]通過對蛋白質的理化參數、跨膜結構域、信號肽、磷酸化位點、二級結構、三級結構和T、B細胞表位的預測，利用分子對接技術優化細胞表位，構建了EgTeg和EgFABP1的多表位疫苗，這種多表位疫苗在小鼠實驗中表現出良好的免疫原性，能顯著減輕原頭蚴腹腔注射感染小鼠的棘球蚴囊腫重量。此外，Eg14-3-3 [52]、EgP29 [97]、EgM9、Eg10196、EgA31、EgG1Y162 [98-99]等抗原也被用于預測T細胞和B細胞表位，但目前缺乏免疫原性和免疫保護效果評估的相關數據以支撐其應用的可行性。
計算機輔助設計可以開發具有高免疫原性和高安全性的疫苗，它能夠為棘球蚴病防控提供新的策略和方法。但不同的軟件可能使用不同的算法和數據源，導致表位預測結果的差異。因此，為了提高表位預測的準確性，使用多個軟件同時進行預測并綜合考慮預測結果是必要的。
2.5 載體疫苗
載體疫苗是一類利用DNA重組技術，通過細菌、真菌、病毒或納米顆粒等載體將目標抗原基因或蛋白傳遞到機體免疫系統，誘導特異性免疫應答的疫苗。常見的載體有酵母、病毒、細菌、納米顆粒等。目前已被文獻報道的棘球蚴病疫苗載體包括：精氨酸納米脂質顆粒 [83]、納米細胞膜囊泡 [100]、牛痘病毒 [101]、沙門氏菌 [102]、BCG [103]、乳酸乳球菌 [104]、雙歧桿菌 [105]、狂犬病毒 [106]等。細菌載體疫苗研究占比最多，但僅有少數研究評估了疫苗的免疫保護效率（表5） [64, 101, 103, 107-110]，其中以BCG為載體的疫苗對棘球蚴囊腫的抑制率最高（為92.46%） [103]。除了細菌載體疫苗，以納米細胞膜囊泡為載體的T細胞和B細胞多表位疫苗（V-T/B） [100]首次展示了一種可以減輕多房棘球絳蟲負擔的納米疫苗策略，該疫苗在小鼠實驗中能夠激活樹突狀細胞，并誘導特異性T/B細胞互饋回路，充分發揮細胞免疫和體液免疫在抵抗感染中的作用，最終顯著抑制多房棘球蚴感染和棘球蚴囊腫生長。此外，這些載體疫苗的傳遞方式豐富多樣，涵蓋皮下接種、肌肉接種、呼吸道接種和消化道接種。經呼吸道和消化道接種為家畜和動物免疫提供了便捷的防疫方式，是這類疫苗的優勢。未來載體疫苗在棘球蚴病防控中的應用前景廣闊，但仍需要在安全性、穩定性、免疫原性等方面開展更多研究，需要進一步的臨床試驗數據支撐以促進其轉化和應用。
表5
細菌載體疫苗的應用
3 疫苗研發面臨的主要瓶頸和挑戰
3.1 致病和抵抗機制認知不足
目前，已了解棘球絳蟲入侵和感染的途徑及基本過程，但對棘球絳蟲感染的致病機制和機體免疫防疫機制缺乏全面和系統的認識，特別是對寄生蟲入侵和感染過程中在分子層面的認識，例如，尚不清楚參與棘球絳蟲感染和在宿主體內發育過程中的關鍵分子及其生物學功能。深入探究宿主與棘球絳蟲間相互作用的具體分子機制和免疫反應，將為優化和設計疫苗提供更多的線索和靶點。可以依托合適的動物感染模型，加強對六鉤蚴入侵中間宿主及它在體內生長發育過程中的分子機制和免疫應答的研究，探尋棘球絳蟲感染過程中直接和協助參與入侵宿主的關鍵抗原和靶點，以及棘球絳蟲入侵宿主的關鍵環節。
3.2 實驗用感染性材料的限制
感染動物模型是疫苗研發中不可或缺的環節，缺乏足夠的感染性材料是棘球蚴病感染機制研究和疫苗開發中的挑戰之一。棘球絳蟲主要分布在畜牧業發達的牧區或半牧區，例如，細粒棘球絳蟲的幼蟲階段主要寄生于偶蹄類動物，而成蟲則寄生于犬科動物 [111]。這種生物學限制使得在實驗室條件下持續獲取、長期保存和人工擴增棘球絳蟲在資源獲取和技術上都面臨諸多困難，導致實驗依賴野外人工采集蟲體樣本。因此，加強國內和國際的合作，共享實驗材料、技術平臺及研究成果，減少重復性工作，將加速疫苗候選物的篩選與評估。鑒于獲取感染性材料的困難，還可以考慮開發替代感染模型，如利用細胞系或模式動物模擬棘球絳蟲感染過程。
3.3 有效性評價方式和指標的差異
棘球蚴病疫苗的研發面臨多方面的瓶頸和挑戰。無論是蟲體源蛋白疫苗、重組蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗還是載體疫苗，都面臨如何找到具有更強免疫原性和更好免疫保護效果的抗原問題。比較各種抗原的免疫保護機制和效果有助于加速篩選出最優的疫苗抗原。但由于不同研究之間的接種方式、疫苗佐劑的選擇、動物模型和攻毒方式、以及保護性評價指標存在差異，難以在臨床前階段通過文獻報道的結果直接比較和評價不同候選疫苗間的保護效果。
3.3.1 接種方式與疫苗的保護效果
大多數研究通過皮下注射接種疫苗，而TSP3蛋白 [78]經呼吸道和皮下注射接種小鼠誘導的減囊效率分別為62.8%和81.9%，提示同種抗原采用不同的接種方式所誘導的免疫保護效果存在差異，表明探究疫苗的投遞方式可能有助于進一步提升疫苗的免疫保護效果。近年來有文獻 [112]報道，口服接種疫苗不僅可以誘導系統性的免疫應答，還可以增強消化道局部黏膜免疫應答，具有多重保護優勢。如口服疫苗可以提高患者的依從性，降低注射帶來的風險，簡化給藥過程，減少對醫護人員的需求，以及降低職業暴露導致的傷害等 [113]。鑒于棘球蚴病“病從口入”及六鉤蚴穿透腸黏膜的感染特點，口服接種疫苗和增強局部黏膜免疫反應，從理論上是一種有效的預防棘球蚴感染的方法。
3.3.2 佐劑選擇與疫苗的保護效果
佐劑也是影響疫苗保護效果的重要因素之一。Heath等 [114]使用不同佐劑組合，比較了重組Eg95蛋白疫苗的保護效果，其中包括單獨使用Eg95以及與TASGEL、SAPONIN、ISA70、M888_Drakeol、DEAE_Dextran、QuilA、ISA50、STM等佐劑搭配，結果顯示，Eg95單獨使用時的保護有效率為34%～87%，與上述佐劑分別組合后的保護有效率分別為38%～68%、93%～100%、95%～100%、–10%～95%、64%～100%、86%～100%、63%～99%和70%～100%，結果提示，佐劑的合理選擇和搭配可以提升疫苗的免疫保護效果，對進一步探討不同佐劑組合的優化策略提供了有力的依據。
3.3.3 動物模型與疫苗效果評價
不同動物模型與攻毒方式的差異限制了不同抗原的免疫原性和保護效果的直接比較。在棘球蚴病疫苗的保護效果評價中，攻毒方式主要包括口服蟲卵和腹腔注射原頭蚴兩種感染模型，這兩種攻毒模型的存在導致不同研究中不同抗原的免疫保護效果難以直接比較。六鉤蚴穿透腸壁進入機體是自然感染發生的關鍵環節，而腹腔注射原頭蚴感染小鼠動物模型僅模擬了原頭蚴在宿主腹腔內定植和發育成為囊腫的發病過程 [111]。相比之下，建立經消化道蟲卵自然感染的動物模型是評價疫苗保護效率的必要工具，在模擬感染過程和評估疫苗的有效性方面具有獨特的優勢。Dempster等 [115]報道DBA/2J小鼠經消化道感染Eg蟲卵的有效率約為83.3%；由弘等 [116]報道昆明鼠口服Eg蟲卵的感染有效率為81%。近年的棘球蚴病疫苗研發中腹腔注射原頭蚴感染小鼠的模型約占44%，是評估疫苗保護效率的重要工具。為了更客觀地評價疫苗的免疫保護效果，在疫苗研究中有必要選擇和統一最接近自然感染的攻毒方式。
3.3.4 保護性評價指標
當前的疫苗研究缺乏統一的保護性評價指標。雖然大量重組蛋白疫苗研究已取得一定進展，但保護性評價的指標各異。如棘球蚴囊腫重量減輕率、棘球蚴囊腫數量減少率、成蟲降低率、蟲卵降低率、保護效率等都用作保護性評價的指標，導致各研究間評估結果的差異化和可比性差，阻礙了棘球蚴病保護性抗原有效性的直接評估和比較。因此，為了確保研究結果的可靠性和可比性，迫切需要在棘球蚴病疫苗研究領域建立統一的評估指標和標準化的實驗方法，以便更有效地評估和比較不同實驗室間的抗原保護效果，從而推動棘球蚴病疫苗的研發和應用進程。
3.4 野生動物的免疫預防
僅依靠對家畜免疫接種的措施不能解決物種間反復傳播這一問題和消除環境中分布的蟲卵，因此，預防野生動物感染也是控制和徹底消除棘球蚴病不可忽略的環節。但傳統的動物接種方法無法直接復制和應用于野生動物。“可傳播疫苗” [117]是一種載有來自病原體基因片段的動物病毒，具有個體間傳播能力，通過接觸感染在野生動物種群中傳播，以誘導種群免疫反應，可能是打破棘球蚴病野外傳播鏈的理想工具。2001年，為預防兔黏液瘤病，Torres等 [118]研制表達兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白的重組黏液瘤病毒活疫苗，在小島上為少數野兔接種疫苗后，小島上50%未接種疫苗的野兔也產生了抗原特異性抗體。提示可傳播疫苗在預防人畜共患病方面存在巨大潛力。
4 總結及未來展望
過去幾十年來，中國針對人類、牲畜和家犬的棘球蚴病防控工作取得了重要進展。在教育宣傳、家畜屠宰管理、犬只管理、強制免疫、疫情監控等防控策略的實施下，2022年全國新增病例數量較2004年約下降了50% [22]。然而最新的熱帶病報告 [19]顯示，全球每年仍有31個國家報告了棘球蚴病病例，棘球蚴病仍然為全人類健康帶來了巨大的威脅和造成了嚴重的經濟負擔 [119-120]，完全消除棘球蚴病尚需全人類的共同和繼續努力。
疫苗作為控制傳染病的最有效和最經濟的手段，其研發是一項極具挑戰性的任務。盡管當前已有針對細粒棘球絳蟲的獸用疫苗，但該疫苗的設計有待優化，免疫保護效果有待提升。構建的很多候選疫苗尚無充分的免疫保護性評價，約23%的棘球蚴病疫苗研究僅停留在實驗室階段，多數候選疫苗有待臨床試驗的評價，以促進其進一步推廣和應用。若能克服棘球蚴病疫苗研發過程中面臨的諸多挑戰，必定會加速疫苗的研發和棘球蚴病防控的進程。
總之，棘球蚴病的防控雖然面臨致病和抵抗機制、疫苗研發技術、野生動物傳播等諸多挑戰，但通過對疾病感染和免疫防疫機制的深入研究以及創新技術的運用，有望開發出更多安全有效的棘球蚴病疫苗，以控制棘球蚴病的流行。特別是對于經濟欠發達的地區，棘球蚴病防控帶來的收益遠不止保障當地農牧民的健康，還能幫助當地農牧民實現生計改善，完成“全國所有流行縣基本控制棘球蚴病流行”和“健康中國2030”的目標和任務，真正實現在全球消滅棘球蚴病。
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