引用本文： 李婧雯, 李超乾. 外泌體在急性肺損傷中的研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(2): 144-149. doi: 10.7507/1671-6205.202303008 復制
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急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種常見的急危重癥綜合征，病死率高達35%-46%[1]。以失控的炎癥反應和肺泡-毛細血管屏障受損造成的彌漫性肺間質、肺泡水腫為主要特征[2]。目前，ARDS的主要治療策略仍以機械通氣、體外膜肺氧合（ECMO）及限制性液體管理等支持治療為主[3-4]，由于缺乏有效的治療手段，大多數ALI/ARDS患者預后不良。近年來，外泌體領域迅速發展，它們已被證明參與細胞信號轉導、細胞間通訊和相關生物學過程，在多種疾病的進展過程中發揮至關重要的作用，外泌體作為新型生物標志物和新療法在ALI/ARDS中的應用受到了廣泛關注。本文就外泌體在ALI/ARDS發病機制、臨床診斷及潛在應用價值進行綜述。
1 外泌體概述
外泌體是細胞外囊泡（EVs）的一種，直徑約為30～150 nm，是由細胞質膜內陷形成的多囊泡體與細胞膜融合后，以胞吐形式釋放到細胞外基質的囊泡[5]。外泌體可存在于多種體液中，例如支氣管肺泡灌洗液（BALF）、血液、痰液和尿液等。體內幾乎所有類型的細胞都可以分泌外泌體，包括干細胞、腫瘤細胞和免疫細胞[6-8]。外泌體含有與母細胞相關的蛋白質、核酸和脂質等多種生物學活性物質，當它們從細胞中釋放后通過內吞作用、直接與細胞膜融合的方式被鄰近或遠處的細胞攝取，隨后釋放其內容物調節受體細胞相關基因的表達，或與靶細胞表面的特定受體相互作用并激活相關信號通路，從而實現細胞間的通訊[9-11]。
外泌體在生理和病理狀態下具有不同的生物理化特性及功能，在各類疾病的發生發展過程中發揮重要作用，包括心血管系統、呼吸系統以及一些自身免疫性疾病等[12]。有研究者發現BALF中的外泌體含有組織相溶復合體（MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子并表達共刺激分子CD86，這表明氣道外泌體可能參與抗原呈遞、調控適應性免疫反應并介導共刺激[13]。肺癌細胞來源的外泌體攜帶有多種免疫抑制分子和因子，通過影響腫瘤微環境中的免疫效應細胞功能，幫助腫瘤免疫逃逸[14-15]。來自肺部結構細胞（內皮細胞和上皮細胞）和免疫細胞（巨噬細胞和中性粒細胞）的外泌體，通過轉移miRNA、促炎細胞因子等，促進氣道重塑和纖維化，從而影響肺部慢性炎癥的發展 [16]。在氣道和肺泡中，外泌體能夠維持肺部穩態，也能誘導促炎、促進抗原呈遞，從而參與調節肺部炎癥和免疫應答。
2 外泌體參與ALI/ARDS發病機制
2.1 外泌體對巨噬細胞的作用
ALI/ARDS的特點之一是肺泡巨噬細胞的激活，激活的巨噬細胞通過釋放大量的炎癥介質與相應細胞表面受體結合，吞噬病原體及激活肺部其他細胞，參與調控炎癥反應和維持氣道免疫平衡。
不同細胞來源的外泌體在被肺泡巨噬細胞攝取后，可以引發炎癥反應，導致急性肺損傷。Chen等[17]將單核細胞來源的外泌體作用于巨噬細胞發現，外泌體lncRNA CLMAT3特異性靶向羧基末端結合蛋白2（CtBP2），CtBP2和組蛋白乙酰轉移酶p300與核轉錄因子-κB（NF-κB）組成轉錄復合物激活巨噬細胞大量釋放IL-1β、IL-6、TNFα等促炎性細胞因子。此外，中性粒細胞的外泌體，通過傳遞miR-30d-5p也能激活NF-κB通路從而誘導巨噬細胞極化和焦亡[18]。Liu等[19]發現肺泡上皮細胞外泌體miR-92a-3p通過調控NF-κB通路促進巨噬細胞活化并介導炎癥。上皮細胞還可以分泌 IL-25下調肺泡巨噬細胞中的Rab27a和Rab27b的表達，從而抑制巨噬細胞外泌體的釋放以減輕ALI[20]。另有研究發現肺泡上皮細胞分泌的CD74+ 外泌體對肺泡巨噬細胞具有促炎和抗纖維化作用，而血管內皮細胞分泌的CD31+外泌體對肺泡巨噬細胞有抗炎和促纖維化作用，這是由外泌體攜帶的miR-27b-3p和miR-223分別介導的[21]。總的來說，外泌體在肺損傷中對巨噬細胞不完全都是損傷作用，也具有保護作用，這取決于其細胞來源類型及所含物質。
外泌體可以被分泌到各種液體中，包括血液，研究發現在脂多糖（LPS）誘導的ALI小鼠外周血中富含外泌體，血清來源的外泌體miR-155，通過靶向含SH2結構域的肌醇5-磷酸酶1（SHIP1）和細胞因子信號傳導抑制因子1（SOCS1）促進巨噬細胞的增殖和炎癥反應[22]。另有研究表明，在急性胰腺炎（AP）相關的ALI模型中，血漿來源的外泌體通過激活巨噬細胞中的NLRP3炎癥小體導致巨噬細胞焦亡，觸發炎癥級聯反應[23]。上述研究為循環外泌體能夠靶向肺泡巨噬細胞而引起肺損傷提供證據，然而對于血源性外泌體的確切來源還尚未闡明，明確這些外泌體的起源將有助于進一步了解外泌體參與調節ALI的機制。
2.2 外泌體對上皮細胞的作用
肺泡上皮細胞主要由Ⅰ型肺泡上皮細胞（AEC-I）和Ⅱ型肺泡上皮細胞（AEC-II）組成。AEC-I在氣體交換、免疫調節、水和離子轉運等方面起著關鍵作用。AEC-II可以募集免疫效應細胞并分泌多種抗菌肽來協調先天免疫，此外，AEC-II具有增殖及分化成AEC-I的能力，其合成的肺泡表面活性物質可以維持肺泡表面張力[24-25]。
氣道上皮是抵御外界環境的第一道防線，越來越多的證據表明，在ALI發生時，外泌體可以引起氣道上皮功能失調。例如，膿毒癥相關ALI患者的外泌體miR-1298-5p上調，通過抑制支氣管上皮細胞的增殖和誘導上皮細胞通透性增加引發肺部炎癥[26]。Yuan等[27]從LPS誘導的ALI小鼠模型中收集BALF，研究發現BALF來源的外泌體包含了參與調節炎癥的miRNA和細胞因子，且這些外泌體可以通過影響支氣管上皮細胞中緊密連接蛋白（ZO-1）的表達來破壞結構屏障。推測這可能與在感染、高氧等刺激后，肺內免疫細胞大量釋放外泌體到氣道表面，導致免疫調節失衡有關[28]。在膿毒癥相關ALI大鼠模型中，肺泡巨噬細胞釋放的外泌體通過氨基肽酶 N（APN）與上皮表面受體TLR4結合導致支氣管上皮細胞功能紊亂[29]。需要注意的是，免疫細胞來源的外泌體對炎癥微環境的調控是雙向的。一項研究報道，肺泡巨噬細胞釋放的外泌體和微囊泡中攜帶有SOCS1和SOCS3，SOCS蛋白家族是JAK-STAT信號通路內源性抑制劑，當肺泡上皮細胞攝取外泌體后，通過SOCS1阻止STAT信號通路激活，從而抑制肺泡上皮細胞的炎癥反應[30]。
2.3 外泌體對內皮細胞的作用
來源于循環EVs可破壞內皮細胞，激活下游信號通路，調節內皮細胞炎癥、氧化應激和細胞凋亡，導致肺血管嚴重滲出，進一步加重ALI。Gao等[31]研究發現來自ALI大鼠的外泌體分泌miR-1-3p至內皮細胞，上調的miR-1-3p通過靶向內質網應激相關蛋白1（SERP1）促進細胞凋亡和細胞骨架收縮，增加單層內皮細胞的通透性和膜損傷，最終導致ALI。除miRNAs外， EVs還攜帶有破壞內皮屏障的蛋白。激活的焦亡相關蛋白Gasdermin D（GSDMD）會裂解釋放其30kDa N末端結構域（p30），GSDMD-p30可以在細胞膜上形成孔隙，導致細胞腫脹、細胞膜破裂、細胞死亡，在暴露于高氧的大鼠血漿EVs中檢測到GSDMD-p30增多，將EVs注射到新生大鼠體內，誘發了肺血管內皮細胞死亡和炎癥反應[32]。此外，Gambim等[33]研究表明膿毒癥患者血小板的外泌體具有超氧化物生成活性，通過激活活性氧（ROS）、活性氮（RNS）生成，誘導內皮細胞半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活化并促進內皮細胞凋亡。這些研究提示，外泌體可能導致內皮功能障礙，引起血管病變，其中負載的生物活性物質是其發揮作用的關鍵，調節外泌體中重要蛋白或miRNA的表達可以恢復內皮細胞之間的緊密連接，減少內皮細胞功能紊亂引起的肺損傷。除此之外，外泌體還轉運一些有利于減輕內皮細胞介導肺損傷的蛋白。多配體蛋白聚糖-1（syndecan-1）具有保護屏障和抑制炎癥反應的潛力，負載syndecan-1的外泌體可以減輕LPS刺激后促炎細胞因子的表達，改善小鼠肺微血管內皮細胞的通透性[34]。
2.4 外泌體對中性粒細胞的作用
在趨化因子的作用下大量中性粒細胞迅速募集至肺損傷部位，中性粒細胞遷移時會釋放有毒介質，包括蛋白酶、ROS和中性粒細胞胞外誘捕網（NETs），這些介質在防御病原體的同時也會破壞細胞間連接、引起細胞凋亡從而加重肺損傷[35]。有研究發現，凝血酶誘導的血小板EVs通過直接作用于NETs，導致輸血相關的ALI[36]。從LPS刺激的血小板中分離出的外泌體，通過高遷移率族蛋白1（HMGB1）、miR-15b-5p、miR-378a-3p激活中性粒細胞內自噬相關的Akt/mTOR通路，誘導NETs形成，促進膿毒癥相關的ALI[37]。這些研究表明血小板可能通過其外泌體與活化的中性粒細胞相互作用，誘導NETs形成，從而進一步加重肺損傷。最近的一項研究發現[38]，從肺組織分離出的EVs在骨髓中積聚，在炎癥條件下，肺部EVs通過傳遞雙鏈DNA在體內和體外刺激骨髓中性粒細胞釋放趨化因子CXCL1和CXCL2，增強中性粒細胞趨化性，促進中性粒細胞募集至病灶區域，而在正常的小鼠中沒有檢測到顯著差異，這表明肺EVs不是直接誘導中性粒細胞募集的因素，而是增強中性粒細胞響應炎癥信號的媒介。該項研究還進一步探究了肺組織EVs的親本細胞，通過對肺組織來源的EVs進行蛋白質組學和單細胞RNA測序分析，結果表明肺組織EVs的主要來源是II型肺泡上皮細胞。
3 外泌體在ALI/ARDS診斷價值
來自肺組織和細胞的外泌體攜帶有與肺損傷相關的分子,在病理條件下，外泌體的數量或組成會發生變化，這些變化可以作為ALI/ARDS的特征信號在血液或BALF中檢測到，這使得外泌體具有成為疾病診斷生物標志物的潛力。
來自BALF的外泌體與ARDS的肺部損傷嚴重程度存在一定的相關性[39]。有學者從158名ARDS患者BALF中分離出外泌體，通過分析外泌體水平與臨床數據之間的相關性，發現它與氧合指數（PaO2/FiO2）呈負相關，感染性病因引起的ARDS患者BALF外泌體水平高于沒有感染性病因的患者，這表明BALF外泌體的含量與病因和氧濃度密切相關[40]。早期ARDS患者BALF中的分泌性磷脂酶A2-ⅡA蛋白（sPLA2-ⅡA）水平升高與疾病的臨床嚴重程度呈正相關，而sPLA2-ⅡA僅在早期ARDS的BALF外泌體中檢測到，這提示其可能作為ARDS早期診斷的標志物[41]。在一項關于血清外泌體miRNAs預測嚴重社區獲得性肺炎（SCAP）患者的ARDS的臨床研究中，ARDS組的外泌體miR-146a、miR-27a、miR-126和miR-155的表達水平顯著高于非ARDS組，單個miRNA的曲線下面積（AUC）值在0.592和0.779之間,而聯合4個miRNA的AUC大于任何單個miRNA（AUC=0.909，P<0.001，95%置信區間為0.815～1），這提示miR-126、miR-27a、miR-146a和miR-155的聯合表達可用于預測ARDS[42]。此外，在膿毒癥患者血清外泌體中hsa_circRNA_104484和hsa_circRNA_104670的表達增強，circRNA可能作為 ALI發生的標志物[43]。另有研究從膿毒癥患者中分離了血漿外泌體，發現外泌體CD63水平的升高與器官衰竭的嚴重程度相關，并且能預測膿毒癥重癥患者的死亡率[44]。上述的研究表明，外泌體及其內容物可應用于ALI/ARDS早期診斷和判斷預后，為盡早預警疾病風險，提供合適生物標志物。
4 外泌體在ALI/ARDS治療上的潛在應用
4.1 細胞來源的外泌體在治療中的作用
目前，ARDS的治療主要為支持性措施，但基于外泌體的治療已經顯現出了美好前景。其中，間充質干細胞（MSCs)來源廣泛，其釋放的外泌體在ALI/ARDS臨床前研究中顯示出良好的治療效果。例如，MSCs來源的外泌體已被證明可以抑制肺組織中巨噬細胞的聚集，抑制IL-27的分泌，降低肺組織中促炎性細胞因子的水平并提高小鼠的生存率[45]。Wei等[46]發現MSCs外泌體通過誘導體內自噬，可以降低炎癥因子的水平并抑制肺部炎癥和氧化應激。此外，在ALI小鼠模型中，MSCs外泌體將miR-30b-3p轉移至Ⅱ型肺泡上皮細胞，通過下調血清淀粉樣蛋白A3 （SAA3）促進細胞增殖并抑制上皮細胞凋亡[47]。MSCs分泌的外泌體通過PI3K/Akt信號通路在體外和體內模型中減少了內皮細胞的凋亡并減輕了血管的高滲透性[48]，對內皮細胞產生保護作用。
隨著新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的爆發，它已發展成為全球公共衛生緊急事件，嚴重的COVID-19感染可導致雙側間質性肺炎，常進展為ARDS和幸存者的肺纖維化。近年來，國內外已有團隊開展了MSCs外泌體用于治療COVID-19的臨床研究并且療效顯著。在一項臨床試驗中，重癥COVID-19患者接受了單次靜脈注射骨髓來源的外泌體治療，結果顯示外泌體改善了患者的缺氧癥狀，同時減輕了細胞因子風暴和促進免疫重建，并且無不良反應發生[49]。 無錫市第五人民醫院采用霧化吸入的方式，對COVID-19患者進行了臍帶間充質干細胞外泌體的治療，外泌體治療促進了肺部病變的吸收并縮短了輕度COVID-19患者的住院時間，該研究表明在感染早期霧化MSCs來源的外泌體治療可能對患者更有益。此外，霧化的方式可直接將藥物送到細支氣管和肺泡中，更有利于藥物充分吸收，該試驗還觀察到霧化吸入MSCs來源的外泌體的患者未誘發過敏反應，初步為以霧化方式進行外泌體治療的臨床研究提供了參考數據[50]。
除了間充質干細胞外，其他細胞來源的外泌體也在ALI/ARDS中發揮保護作用。有研究發現內皮祖細胞（EPC）外泌體可以通過減少局部炎癥細胞因子、降低肺泡通透性和抑制中性粒細胞遷移來減少LPS引起的ALI[51]。另一項研究則表明EPC外泌體可以通過增強RAF/ERK信號通路的表達以促進內皮細胞功能恢復，進而改善ALI/ARDS的預后[52]。Jiang等[53]發現內皮細胞外泌體通過轉移miR-125b-5p可以抑制拓撲異構酶IIα（TOP2A）的表達，從而緩解肺損傷，而轉染miR-125b-5p抑制劑則逆轉了外泌體這一作用。
近期的研究結果表明外泌體是ALI/ARDS患者治療的潛在候選藥物，外泌體可以將mRNA、miRNA、蛋白質等轉移到靶細胞和組織中，改變基因表達，調節靶細胞的行為，以減輕ALI/ARDS的炎癥反應和細胞凋亡，改善內皮細胞功能以及修復上皮損傷，在ALI/ARDS中發揮保護作用。
4.2 作為物質載體的外泌體在治療中的作用
外泌體體積小，且具有逃避吞噬、容易穿過呼吸道內膜層等特性，可以作為肺部藥物傳遞的載體，實現靶向藥物輸送。越來越多的研究已經開發出基于外泌體的藥物遞送治療策略，miR-223-3p是炎癥反應的一個有效調節器，在LPS刺激的BALF外泌體中miR-223-3p表達水平下調，通過構建負載miR-223-3p的外泌體，可以有效抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶39 （STK39）的表達，促進肺泡巨噬細胞自噬并緩解肺損傷[54]。晚期糖基化終末產物受體結合肽（RBP）是一種抗炎肽，設計將RBP與外泌體膜整體蛋白Lamp2b連接，把疏水性藥物姜黃素包裹到外泌體內，構建包含RBP和姜黃素的工程化外泌體，外泌體可以被肺部吸收，提高了姜黃素和RBP的傳遞效率和抗炎效果[55]。通過技術手段將特定miRNA按比例加載到特殊材質的納米粒子中，合成一種免疫抑制性外泌體模擬物，外泌體模擬物可以以劑量依賴的方式保護內皮細胞、抑制炎癥反應和減輕膿毒癥[56]。天然外泌體介導的藥物遞送具有低毒性、低免疫原性的優勢，工程化外泌體還可以在此基礎上提高藥物負載效率、靶向能力、穩定性等，將工程化外泌體用于ALI/ARDS的無細胞靶向治療是一種可行策略。
外泌體是細胞間通訊的重要介質，通過傳遞其內容物（miRNA、蛋白質、mRNA等）實現細胞間的信號傳遞，外泌體已經開始作為ALI/ARDS的潛在診斷生物標志物及治療手段進入研究，是當前的研究熱點之一。
大量臨床前研究已證明間充質干細胞來源的外泌體具有調節免疫、減少炎癥及修復組織的作用，對ALI癥狀具有緩解治療效果。此外，由于外泌體具有低毒性、低免疫原性等獨特的生物學特性，外泌體可以用于靶向遞送藥物，通過生物工程技術修飾外泌體負載藥物，還可以人工處理其表面特異性受體以將外泌體轉移到靶細胞，這種利用外泌體遞送治療藥物的新方法在醫學上具有巨大前景。
然而，要進一步實現基于外泌體的治療策略在ALI/ARDS中的臨床轉化仍具有挑戰性，首先，外泌體影響ALI/ARDS的機制尚不完全清楚，許多機制還有待探索。第二，缺乏標準化的外泌體分離技術、儲存方法和質量把控，需要解決外泌體標準化的問題以確保外泌體的質量及治療效果。第三，現階段關于外泌體在ALI/ARDS中的探索主要集中于基礎研究，仍需要更多的基礎實驗和臨床數據來驗證其應用于臨床的安全性和有效性。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。
急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種常見的急危重癥綜合征，病死率高達35%-46%[1]。以失控的炎癥反應和肺泡-毛細血管屏障受損造成的彌漫性肺間質、肺泡水腫為主要特征[2]。目前，ARDS的主要治療策略仍以機械通氣、體外膜肺氧合（ECMO）及限制性液體管理等支持治療為主[3-4]，由于缺乏有效的治療手段，大多數ALI/ARDS患者預后不良。近年來，外泌體領域迅速發展，它們已被證明參與細胞信號轉導、細胞間通訊和相關生物學過程，在多種疾病的進展過程中發揮至關重要的作用，外泌體作為新型生物標志物和新療法在ALI/ARDS中的應用受到了廣泛關注。本文就外泌體在ALI/ARDS發病機制、臨床診斷及潛在應用價值進行綜述。
1 外泌體概述
外泌體是細胞外囊泡（EVs）的一種，直徑約為30～150 nm，是由細胞質膜內陷形成的多囊泡體與細胞膜融合后，以胞吐形式釋放到細胞外基質的囊泡[5]。外泌體可存在于多種體液中，例如支氣管肺泡灌洗液（BALF）、血液、痰液和尿液等。體內幾乎所有類型的細胞都可以分泌外泌體，包括干細胞、腫瘤細胞和免疫細胞[6-8]。外泌體含有與母細胞相關的蛋白質、核酸和脂質等多種生物學活性物質，當它們從細胞中釋放后通過內吞作用、直接與細胞膜融合的方式被鄰近或遠處的細胞攝取，隨后釋放其內容物調節受體細胞相關基因的表達，或與靶細胞表面的特定受體相互作用并激活相關信號通路，從而實現細胞間的通訊[9-11]。
外泌體在生理和病理狀態下具有不同的生物理化特性及功能，在各類疾病的發生發展過程中發揮重要作用，包括心血管系統、呼吸系統以及一些自身免疫性疾病等[12]。有研究者發現BALF中的外泌體含有組織相溶復合體（MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子并表達共刺激分子CD86，這表明氣道外泌體可能參與抗原呈遞、調控適應性免疫反應并介導共刺激[13]。肺癌細胞來源的外泌體攜帶有多種免疫抑制分子和因子，通過影響腫瘤微環境中的免疫效應細胞功能，幫助腫瘤免疫逃逸[14-15]。來自肺部結構細胞（內皮細胞和上皮細胞）和免疫細胞（巨噬細胞和中性粒細胞）的外泌體，通過轉移miRNA、促炎細胞因子等，促進氣道重塑和纖維化，從而影響肺部慢性炎癥的發展 [16]。在氣道和肺泡中，外泌體能夠維持肺部穩態，也能誘導促炎、促進抗原呈遞，從而參與調節肺部炎癥和免疫應答。
2 外泌體參與ALI/ARDS發病機制
2.1 外泌體對巨噬細胞的作用
ALI/ARDS的特點之一是肺泡巨噬細胞的激活，激活的巨噬細胞通過釋放大量的炎癥介質與相應細胞表面受體結合，吞噬病原體及激活肺部其他細胞，參與調控炎癥反應和維持氣道免疫平衡。
不同細胞來源的外泌體在被肺泡巨噬細胞攝取后，可以引發炎癥反應，導致急性肺損傷。Chen等[17]將單核細胞來源的外泌體作用于巨噬細胞發現，外泌體lncRNA CLMAT3特異性靶向羧基末端結合蛋白2（CtBP2），CtBP2和組蛋白乙酰轉移酶p300與核轉錄因子-κB（NF-κB）組成轉錄復合物激活巨噬細胞大量釋放IL-1β、IL-6、TNFα等促炎性細胞因子。此外，中性粒細胞的外泌體，通過傳遞miR-30d-5p也能激活NF-κB通路從而誘導巨噬細胞極化和焦亡[18]。Liu等[19]發現肺泡上皮細胞外泌體miR-92a-3p通過調控NF-κB通路促進巨噬細胞活化并介導炎癥。上皮細胞還可以分泌 IL-25下調肺泡巨噬細胞中的Rab27a和Rab27b的表達，從而抑制巨噬細胞外泌體的釋放以減輕ALI[20]。另有研究發現肺泡上皮細胞分泌的CD74+ 外泌體對肺泡巨噬細胞具有促炎和抗纖維化作用，而血管內皮細胞分泌的CD31+外泌體對肺泡巨噬細胞有抗炎和促纖維化作用，這是由外泌體攜帶的miR-27b-3p和miR-223分別介導的[21]。總的來說，外泌體在肺損傷中對巨噬細胞不完全都是損傷作用，也具有保護作用，這取決于其細胞來源類型及所含物質。
外泌體可以被分泌到各種液體中，包括血液，研究發現在脂多糖（LPS）誘導的ALI小鼠外周血中富含外泌體，血清來源的外泌體miR-155，通過靶向含SH2結構域的肌醇5-磷酸酶1（SHIP1）和細胞因子信號傳導抑制因子1（SOCS1）促進巨噬細胞的增殖和炎癥反應[22]。另有研究表明，在急性胰腺炎（AP）相關的ALI模型中，血漿來源的外泌體通過激活巨噬細胞中的NLRP3炎癥小體導致巨噬細胞焦亡，觸發炎癥級聯反應[23]。上述研究為循環外泌體能夠靶向肺泡巨噬細胞而引起肺損傷提供證據，然而對于血源性外泌體的確切來源還尚未闡明，明確這些外泌體的起源將有助于進一步了解外泌體參與調節ALI的機制。
2.2 外泌體對上皮細胞的作用
肺泡上皮細胞主要由Ⅰ型肺泡上皮細胞（AEC-I）和Ⅱ型肺泡上皮細胞（AEC-II）組成。AEC-I在氣體交換、免疫調節、水和離子轉運等方面起著關鍵作用。AEC-II可以募集免疫效應細胞并分泌多種抗菌肽來協調先天免疫，此外，AEC-II具有增殖及分化成AEC-I的能力，其合成的肺泡表面活性物質可以維持肺泡表面張力[24-25]。
氣道上皮是抵御外界環境的第一道防線，越來越多的證據表明，在ALI發生時，外泌體可以引起氣道上皮功能失調。例如，膿毒癥相關ALI患者的外泌體miR-1298-5p上調，通過抑制支氣管上皮細胞的增殖和誘導上皮細胞通透性增加引發肺部炎癥[26]。Yuan等[27]從LPS誘導的ALI小鼠模型中收集BALF，研究發現BALF來源的外泌體包含了參與調節炎癥的miRNA和細胞因子，且這些外泌體可以通過影響支氣管上皮細胞中緊密連接蛋白（ZO-1）的表達來破壞結構屏障。推測這可能與在感染、高氧等刺激后，肺內免疫細胞大量釋放外泌體到氣道表面，導致免疫調節失衡有關[28]。在膿毒癥相關ALI大鼠模型中，肺泡巨噬細胞釋放的外泌體通過氨基肽酶 N（APN）與上皮表面受體TLR4結合導致支氣管上皮細胞功能紊亂[29]。需要注意的是，免疫細胞來源的外泌體對炎癥微環境的調控是雙向的。一項研究報道，肺泡巨噬細胞釋放的外泌體和微囊泡中攜帶有SOCS1和SOCS3，SOCS蛋白家族是JAK-STAT信號通路內源性抑制劑，當肺泡上皮細胞攝取外泌體后，通過SOCS1阻止STAT信號通路激活，從而抑制肺泡上皮細胞的炎癥反應[30]。
2.3 外泌體對內皮細胞的作用
來源于循環EVs可破壞內皮細胞，激活下游信號通路，調節內皮細胞炎癥、氧化應激和細胞凋亡，導致肺血管嚴重滲出，進一步加重ALI。Gao等[31]研究發現來自ALI大鼠的外泌體分泌miR-1-3p至內皮細胞，上調的miR-1-3p通過靶向內質網應激相關蛋白1（SERP1）促進細胞凋亡和細胞骨架收縮，增加單層內皮細胞的通透性和膜損傷，最終導致ALI。除miRNAs外， EVs還攜帶有破壞內皮屏障的蛋白。激活的焦亡相關蛋白Gasdermin D（GSDMD）會裂解釋放其30kDa N末端結構域（p30），GSDMD-p30可以在細胞膜上形成孔隙，導致細胞腫脹、細胞膜破裂、細胞死亡，在暴露于高氧的大鼠血漿EVs中檢測到GSDMD-p30增多，將EVs注射到新生大鼠體內，誘發了肺血管內皮細胞死亡和炎癥反應[32]。此外，Gambim等[33]研究表明膿毒癥患者血小板的外泌體具有超氧化物生成活性，通過激活活性氧（ROS）、活性氮（RNS）生成，誘導內皮細胞半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活化并促進內皮細胞凋亡。這些研究提示，外泌體可能導致內皮功能障礙，引起血管病變，其中負載的生物活性物質是其發揮作用的關鍵，調節外泌體中重要蛋白或miRNA的表達可以恢復內皮細胞之間的緊密連接，減少內皮細胞功能紊亂引起的肺損傷。除此之外，外泌體還轉運一些有利于減輕內皮細胞介導肺損傷的蛋白。多配體蛋白聚糖-1（syndecan-1）具有保護屏障和抑制炎癥反應的潛力，負載syndecan-1的外泌體可以減輕LPS刺激后促炎細胞因子的表達，改善小鼠肺微血管內皮細胞的通透性[34]。
2.4 外泌體對中性粒細胞的作用
在趨化因子的作用下大量中性粒細胞迅速募集至肺損傷部位，中性粒細胞遷移時會釋放有毒介質，包括蛋白酶、ROS和中性粒細胞胞外誘捕網（NETs），這些介質在防御病原體的同時也會破壞細胞間連接、引起細胞凋亡從而加重肺損傷[35]。有研究發現，凝血酶誘導的血小板EVs通過直接作用于NETs，導致輸血相關的ALI[36]。從LPS刺激的血小板中分離出的外泌體，通過高遷移率族蛋白1（HMGB1）、miR-15b-5p、miR-378a-3p激活中性粒細胞內自噬相關的Akt/mTOR通路，誘導NETs形成，促進膿毒癥相關的ALI[37]。這些研究表明血小板可能通過其外泌體與活化的中性粒細胞相互作用，誘導NETs形成，從而進一步加重肺損傷。最近的一項研究發現[38]，從肺組織分離出的EVs在骨髓中積聚，在炎癥條件下，肺部EVs通過傳遞雙鏈DNA在體內和體外刺激骨髓中性粒細胞釋放趨化因子CXCL1和CXCL2，增強中性粒細胞趨化性，促進中性粒細胞募集至病灶區域，而在正常的小鼠中沒有檢測到顯著差異，這表明肺EVs不是直接誘導中性粒細胞募集的因素，而是增強中性粒細胞響應炎癥信號的媒介。該項研究還進一步探究了肺組織EVs的親本細胞，通過對肺組織來源的EVs進行蛋白質組學和單細胞RNA測序分析，結果表明肺組織EVs的主要來源是II型肺泡上皮細胞。
3 外泌體在ALI/ARDS診斷價值
來自肺組織和細胞的外泌體攜帶有與肺損傷相關的分子,在病理條件下，外泌體的數量或組成會發生變化，這些變化可以作為ALI/ARDS的特征信號在血液或BALF中檢測到，這使得外泌體具有成為疾病診斷生物標志物的潛力。
來自BALF的外泌體與ARDS的肺部損傷嚴重程度存在一定的相關性[39]。有學者從158名ARDS患者BALF中分離出外泌體，通過分析外泌體水平與臨床數據之間的相關性，發現它與氧合指數（PaO2/FiO2）呈負相關，感染性病因引起的ARDS患者BALF外泌體水平高于沒有感染性病因的患者，這表明BALF外泌體的含量與病因和氧濃度密切相關[40]。早期ARDS患者BALF中的分泌性磷脂酶A2-ⅡA蛋白（sPLA2-ⅡA）水平升高與疾病的臨床嚴重程度呈正相關，而sPLA2-ⅡA僅在早期ARDS的BALF外泌體中檢測到，這提示其可能作為ARDS早期診斷的標志物[41]。在一項關于血清外泌體miRNAs預測嚴重社區獲得性肺炎（SCAP）患者的ARDS的臨床研究中，ARDS組的外泌體miR-146a、miR-27a、miR-126和miR-155的表達水平顯著高于非ARDS組，單個miRNA的曲線下面積（AUC）值在0.592和0.779之間,而聯合4個miRNA的AUC大于任何單個miRNA（AUC=0.909，P<0.001，95%置信區間為0.815～1），這提示miR-126、miR-27a、miR-146a和miR-155的聯合表達可用于預測ARDS[42]。此外，在膿毒癥患者血清外泌體中hsa_circRNA_104484和hsa_circRNA_104670的表達增強，circRNA可能作為 ALI發生的標志物[43]。另有研究從膿毒癥患者中分離了血漿外泌體，發現外泌體CD63水平的升高與器官衰竭的嚴重程度相關，并且能預測膿毒癥重癥患者的死亡率[44]。上述的研究表明，外泌體及其內容物可應用于ALI/ARDS早期診斷和判斷預后，為盡早預警疾病風險，提供合適生物標志物。
4 外泌體在ALI/ARDS治療上的潛在應用
4.1 細胞來源的外泌體在治療中的作用
目前，ARDS的治療主要為支持性措施，但基于外泌體的治療已經顯現出了美好前景。其中，間充質干細胞（MSCs)來源廣泛，其釋放的外泌體在ALI/ARDS臨床前研究中顯示出良好的治療效果。例如，MSCs來源的外泌體已被證明可以抑制肺組織中巨噬細胞的聚集，抑制IL-27的分泌，降低肺組織中促炎性細胞因子的水平并提高小鼠的生存率[45]。Wei等[46]發現MSCs外泌體通過誘導體內自噬，可以降低炎癥因子的水平并抑制肺部炎癥和氧化應激。此外，在ALI小鼠模型中，MSCs外泌體將miR-30b-3p轉移至Ⅱ型肺泡上皮細胞，通過下調血清淀粉樣蛋白A3 （SAA3）促進細胞增殖并抑制上皮細胞凋亡[47]。MSCs分泌的外泌體通過PI3K/Akt信號通路在體外和體內模型中減少了內皮細胞的凋亡并減輕了血管的高滲透性[48]，對內皮細胞產生保護作用。
隨著新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的爆發，它已發展成為全球公共衛生緊急事件，嚴重的COVID-19感染可導致雙側間質性肺炎，常進展為ARDS和幸存者的肺纖維化。近年來，國內外已有團隊開展了MSCs外泌體用于治療COVID-19的臨床研究并且療效顯著。在一項臨床試驗中，重癥COVID-19患者接受了單次靜脈注射骨髓來源的外泌體治療，結果顯示外泌體改善了患者的缺氧癥狀，同時減輕了細胞因子風暴和促進免疫重建，并且無不良反應發生[49]。 無錫市第五人民醫院采用霧化吸入的方式，對COVID-19患者進行了臍帶間充質干細胞外泌體的治療，外泌體治療促進了肺部病變的吸收并縮短了輕度COVID-19患者的住院時間，該研究表明在感染早期霧化MSCs來源的外泌體治療可能對患者更有益。此外，霧化的方式可直接將藥物送到細支氣管和肺泡中，更有利于藥物充分吸收，該試驗還觀察到霧化吸入MSCs來源的外泌體的患者未誘發過敏反應，初步為以霧化方式進行外泌體治療的臨床研究提供了參考數據[50]。
除了間充質干細胞外，其他細胞來源的外泌體也在ALI/ARDS中發揮保護作用。有研究發現內皮祖細胞（EPC）外泌體可以通過減少局部炎癥細胞因子、降低肺泡通透性和抑制中性粒細胞遷移來減少LPS引起的ALI[51]。另一項研究則表明EPC外泌體可以通過增強RAF/ERK信號通路的表達以促進內皮細胞功能恢復，進而改善ALI/ARDS的預后[52]。Jiang等[53]發現內皮細胞外泌體通過轉移miR-125b-5p可以抑制拓撲異構酶IIα（TOP2A）的表達，從而緩解肺損傷，而轉染miR-125b-5p抑制劑則逆轉了外泌體這一作用。
近期的研究結果表明外泌體是ALI/ARDS患者治療的潛在候選藥物，外泌體可以將mRNA、miRNA、蛋白質等轉移到靶細胞和組織中，改變基因表達，調節靶細胞的行為，以減輕ALI/ARDS的炎癥反應和細胞凋亡，改善內皮細胞功能以及修復上皮損傷，在ALI/ARDS中發揮保護作用。
4.2 作為物質載體的外泌體在治療中的作用
外泌體體積小，且具有逃避吞噬、容易穿過呼吸道內膜層等特性，可以作為肺部藥物傳遞的載體，實現靶向藥物輸送。越來越多的研究已經開發出基于外泌體的藥物遞送治療策略，miR-223-3p是炎癥反應的一個有效調節器，在LPS刺激的BALF外泌體中miR-223-3p表達水平下調，通過構建負載miR-223-3p的外泌體，可以有效抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶39 （STK39）的表達，促進肺泡巨噬細胞自噬并緩解肺損傷[54]。晚期糖基化終末產物受體結合肽（RBP）是一種抗炎肽，設計將RBP與外泌體膜整體蛋白Lamp2b連接，把疏水性藥物姜黃素包裹到外泌體內，構建包含RBP和姜黃素的工程化外泌體，外泌體可以被肺部吸收，提高了姜黃素和RBP的傳遞效率和抗炎效果[55]。通過技術手段將特定miRNA按比例加載到特殊材質的納米粒子中，合成一種免疫抑制性外泌體模擬物，外泌體模擬物可以以劑量依賴的方式保護內皮細胞、抑制炎癥反應和減輕膿毒癥[56]。天然外泌體介導的藥物遞送具有低毒性、低免疫原性的優勢，工程化外泌體還可以在此基礎上提高藥物負載效率、靶向能力、穩定性等，將工程化外泌體用于ALI/ARDS的無細胞靶向治療是一種可行策略。
外泌體是細胞間通訊的重要介質，通過傳遞其內容物（miRNA、蛋白質、mRNA等）實現細胞間的信號傳遞，外泌體已經開始作為ALI/ARDS的潛在診斷生物標志物及治療手段進入研究，是當前的研究熱點之一。
大量臨床前研究已證明間充質干細胞來源的外泌體具有調節免疫、減少炎癥及修復組織的作用，對ALI癥狀具有緩解治療效果。此外，由于外泌體具有低毒性、低免疫原性等獨特的生物學特性，外泌體可以用于靶向遞送藥物，通過生物工程技術修飾外泌體負載藥物，還可以人工處理其表面特異性受體以將外泌體轉移到靶細胞，這種利用外泌體遞送治療藥物的新方法在醫學上具有巨大前景。
然而，要進一步實現基于外泌體的治療策略在ALI/ARDS中的臨床轉化仍具有挑戰性，首先，外泌體影響ALI/ARDS的機制尚不完全清楚，許多機制還有待探索。第二，缺乏標準化的外泌體分離技術、儲存方法和質量把控，需要解決外泌體標準化的問題以確保外泌體的質量及治療效果。第三，現階段關于外泌體在ALI/ARDS中的探索主要集中于基礎研究，仍需要更多的基礎實驗和臨床數據來驗證其應用于臨床的安全性和有效性。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。