目的觀察氧化應激條件下骨形成蛋白4（BMP4）對人視網膜色素上皮細胞（RPE）增殖和遷移的影響，初步探討其對RPE細胞上皮-間充質轉化（EMT）的作用。方法 將體外培養的人RPE細胞分為正常組、單純4-羥基壬烯醛（HNE）組（4-HNE組）、4-HNE+空白對照組（4-HNE+NC組）、4-HNE+小干擾BMP4組（4-HNE+siBMP4組）。噻唑藍比色法檢測4-HNE對RPE細胞增殖的影響；細胞劃痕實驗測定4-HNE、BMP4對細胞遷移能力的影響；免疫熒光染色、蛋白質免疫印跡法、實時定量聚合酶鏈反應檢測細胞中BMP4的表達；熒光顯微鏡拍照觀察siBMP4轉染效率；流式細胞術檢測細胞線粒體活性氧（MitoSOX）水平；免疫熒光實驗檢測細胞內EMT標志物鈣粘蛋白E（E-cadherin）和纖維連接蛋白（Fibronection）的表達。兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析。結果與正常組比較，4-HNE組細胞增殖、遷移能力明顯增強，差異有統計學意義（t=21.619、24.469，P＜0.05）；細胞內BMP4表達明顯升高，差異有統計學意義（t=19.441，P＜0.05）；BMP4 mRNA、蛋白相對表達量亦顯著升高，差異均有統計學意義（t=26.163、37.163，P＜0.05）。轉染siBMP4 24 h后，RPE細胞中BMP4轉染效率＞90%。與4-HNE組、4-HNE+NC組比較，正常組、4-HNE+siBMP4組細胞內BMP4蛋白（F=27.241）、mRNA（F=36.943）相對表達量、細胞遷移率（F=46.723）、MitoSOX水平（F=39.721）顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；上皮標志物E-cadherin表達顯著增多，間充質標志物Fibronection表達顯著降低，差異均有統計學意義（F= 51.722、45.153，P＜0.05）。結論 氧化應激條件下BMP4抑制RPE增殖和遷移；BMP4參與誘導RPE細胞的EMT過程。
目的觀察氧化應激條件下干擾素基因刺激蛋白（STING）抑制劑對人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）的影響。方法實驗研究。體內動物實驗：將雄性健康C57BL/6J小鼠48只隨機分為野生型小鼠組（WT組）、糖尿病（DM）組，每組各24只。DM組小鼠經鏈脲佐菌素誘導建立DM模型。建模成功后，DM組再分為DM+二甲基亞砜（DMSO）組、DM+C176組，每組各12只小鼠。DM+DMSO組小鼠按50 mg/kg的劑量腹腔注射DMSO；DM+C176組小鼠按50 mg/kg的劑量腹腔注射STING抑制劑C176共750 nmol。建模后4周，采用免疫組織化學染色、蛋白質免疫印跡法、實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測WT組、DM組小鼠視網膜STING表達情況；白細胞粘附實驗檢測WT組、DM+DMSO組、DM+C176組小鼠體內白細胞粘附于hRMEC數量。體外細胞實驗：將hRMEC隨機分為常規培養細胞組（N組）、DMSO組（加入DMSO干預）、C176組（加入C176干預）。各組加入150 μg/ml糖基化終末產物誘導細胞，體外白細胞粘附實驗聯合4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色檢測白細胞粘附于hRMEC數量；流式細胞儀對粘附的白細胞進行定量分析；H2DCFDA/活性氧（ROS）熒光探針檢測細胞中ROS表達情況；Seahorse XFe96細胞能量代謝分析儀測定細胞內糖酵解代謝水平。兩組間比較采用t檢驗；三組間比較采用單因素方差分析。結果體內動物實驗：與WT組比較，DM組小鼠視網膜中STING表達水平（t=73.248）及mRNA（t=67.385）、蛋白（t=69.371）相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與WT組小鼠視網膜血管中白細胞粘附數量比較，DM+DMSO組顯著增加，DM+C176組顯著降低，差異有統計學意義（F=84.352，P＜0.01）。體外細胞實驗：與N組、DMSO組比較，C176組hRMEC上白細胞粘附數量降低，差異有統計學意義（F=35.251，P＜0.01）；與N組比較，DMSO組、C176組hRMEC上外周血白細胞粘附數量降低，差異有統計學意義（F=26.374，P＜0.01）；C176組hRMEC內ROS水平較N組、C176組降低，差異有統計學意義（F=41.362，P＜0.01）；與N組、DMSO組比較，C176組hRMEC的糖酵解水平顯著降低，差異有統計學意義（F=68.741，P＜0.01）。結論抑制白細胞粘附、ROS生成、下調糖酵解水平可抑制STING表達，從而改善視網膜血管內皮細胞功能。
目的觀察p21活化激酶4（PAK4）對視網膜血管內皮細胞行為和線粒體功能的影響。方法實驗研究，分為體內動物實驗和體外細胞實驗兩部分。體內動物實驗：健康C57BL/6J雄性小鼠12只，隨機分為正常對照組、糖尿病組，每組各6只小鼠。糖尿病組小鼠經鏈脲佐菌素誘導建立糖尿病模型。建模后8周，采用蛋白質免疫印跡法、實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測正常對照組、糖尿病組小鼠視網膜PAK4表達情況。體外細胞實驗：人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）分為常規培養細胞組（N組）、空載體組（Vector組）、PAK4過表達組（PAK4組）。各組加入150 μg/ml糖基化終末產物誘導細胞。細胞劃痕實驗檢測各組hRMEC內細胞遷移情況；流式細胞儀檢測各組白細胞粘附于hRMEC數量。Seahorse XFe96細胞能量代謝分析儀測定細胞內線粒體基礎呼吸、三磷酸腺苷（ATP）生成、最大呼吸與備用呼吸能力。兩組間比較采用t檢驗；三組間比較采用單因素方差分析。結果體內動物實驗：與正常對照組小鼠比較，糖尿病組小鼠視網膜中PAK4 mRNA、蛋白相對表達量顯著升高，差異均有統計學意義（t=25.372、22.419、25.372，P＜0.05）。體外細胞實驗：與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC中PAK4蛋白、mRNA相對表達量和細胞遷移率均顯著升高，差異有統計學意義（F=36.821、38.692、29.421，P＜0.05）。流式細胞儀檢測結果顯示，PAK4組hRMEC上白細胞粘附數量明顯升高，差異有統計學意義（F=39.649，P＜0.01）。線粒體壓力測量結果顯示，PAK4組hRMEC內線粒體基礎呼吸、ATP生成、最大呼吸與備用呼吸能力明顯減弱，差異有統計學意義（F=27.472、22.315、31.147、27.472，P＜0.05）。結論PAK4高表達損傷線粒體功能并顯著促進白細胞粘附和內皮細胞遷移。
目的觀察二甲雙胍（Met）對糖尿病（DM）微環境下人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）中核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體及細胞焦亡的影響。方法實驗研究，分為體內動物實驗和體外細胞實驗進行。體內動物實驗：健康C57BL/6J雄性小鼠9只，隨機分為DM組、正常對照組、DM+Met處理組（DM+Met組），每組各3只小鼠。DM組、DM+Met組小鼠經鏈脲佐菌素誘導建立DM模型；DM+Met組給予Met 400 mg/（kg·d）干預。建模后8周，免疫組織化學染色觀察正常對照組、DM組、DM+Met組小鼠視網膜NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D（GSDMD）、cleaved-半胱天冬酶1（Caspase-1）的表達。體外細胞實驗：hRMEC分為常規培養細胞組（N組）、晚期糖基化終末產物（AGE）組、AGE+Met組。AGE組、AGE+Met組加入150 μg/ml AGE誘導細胞，AGE+Met組另加入2.0 mmol/L Met處理細胞。流式細胞儀檢測各組細胞焦亡情況；2', 7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針檢測各組細胞中活性氧（ROS）表達；實時熒光定量聚合酶鏈反應、蛋白質免疫印跡法檢測各組細胞中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA、蛋白相對表達量。三組間比較采用單因素方差分析。結果體內動物實驗：與DM組比較，正常對照組、DM+Met組小鼠視網膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達顯著降低；三組間比較，差異有統計學意義（F=43.478、36.643、24.464，P＜0.01）。體外細胞實驗：流式細胞儀檢測結果顯示，AGE組細胞焦亡率顯著高于N組、AGE+Met組，差異有統計學意義（F=32.598，P＜0.01）。DCFH-DA檢測結果顯示，N組、AGE+Met組細胞內ROS水平較AGE組明顯降低，差異有統計學意義（F=47.267，P＜0.01）。AGE+Met組細胞中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的mRNA（F=51.563、32.192、44.473，P＜0.01）和蛋白（F=63.372、54.463、48.412，P＜0.01）相對表達量較N組顯著下降。結論Met可下調hRMEC內NLRP3炎性小體相關因子表達并抑制細胞焦亡。
目的觀察聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子（PSF）高表達對高濃度4-羥基壬烯醛（4-HNE）誘導下人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）內質網（ER）氧化應激損傷的保護作用。方法體外培養的對數生長期hRMEC分為正常組、單純4-HNE處理組（單純4-HNE組），空載質粒聯合4-HNE處理組（Vec+4-HNE組）、PSF高表達聯合4-HNE處理組（PSF+ 4-HNE組）。單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞培養基加入10 μmol/L 4-HNE，刺激12 h。其后，Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組應用轉染試劑脂質體2000分別導入pcDNA空載體、pcDNA-PSF真核表達質粒，轉染24 h。正常組細胞常規培養。流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率；2'，7'-二氯二氫熒光素雙乙酸鹽探針檢測各組細胞內活性氧（ROS）表達水平。蛋白質免疫印跡法檢測各組細胞內ER氧化物蛋白1（Ero-1）、蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）、C/EBP同源轉錄因子（CHOP）、葡萄糖調節蛋白（GRP）78、蛋白激酶R樣ER激酶（pERK）/磷酸化pERK（p-pERK）、真核起始因子（eIF）2α/磷酸化eIF（peIF）、活化轉錄因子4（ATF4）蛋白相對表達量。組間比較行單因素方差分析。結果單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞凋亡率分別為（22.50±0.58）%、（26.93±0.55）%、（11.70±0.17）%；細胞內ROS表達量分別為0.23±0.03、1.60±0.06、0.50±0.06。三組間細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=24.531，P＜0.05）；Vec+4-HNE組ROS表達水平較單純4-HNE組、PSF+4-HNE組顯著升高，差異有統計學意義（F=37.274，P＜0.05）。正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞ER中Ero-1、PDI蛋白相對表達量分別為1.25±0.03、0.45±0.03、0.63±0.03、1.13±0.09和1.00±0.10、0.27±0.10、0.31±0.05、0.80±0.06；CHOP、GRP78蛋白相對表達量分別為0.55±0.06、1.13±0.09、0.90±0.06、0.48±0.04和0.48±0.04、1.25±0.03、1.03±0.09、0.50±0.06。4組Ero-1（F=43.164）、PDI（F=36.643）、CHOP（F=42.855）、GRP78（F=45.275）蛋白相對表達量比較，差異均有有統計學意義（P＜0.05）。4組細胞ER p-pERK/pERK（F=35.755）、peIF2α/eIF（F=38.643）、ATF4（F=31.275）蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論PSF可抑制高濃度4-HNE誘導的細胞凋亡及ROS產生；其作用機制與恢復ER穩態平衡及下調pERK/eIF2α/ATF4通路的活化水平密切相關。
目的觀察并初步探討骨形成蛋白4（BMP4）靶向調控SMAD9表達對Müller細胞遷移、活性氧（ROS）生成以及血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法體外培養的Müller細胞分為正常對照組、BMP4組、BMP4+空載質粒組（BMP4+NC組）、BMP4+SMAD9小干擾質粒組（BMP4+siSMAD9）。BMP4組、BMP4+NC組、BMP4+siSMAD9組細胞培養基加入100 ng/ml BMP4誘導細胞24 h。其后，BMP4+NC組轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9組轉染SMAD9小干擾質粒48 h。細胞劃痕實驗測定BMP4對Müller細胞遷移的影響；流式細胞儀檢測BMP4對Müller細胞內ROS生成的影響；蛋白質免疫印跡法（Western blots）、實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測Müller細胞內谷氨酰胺合成酶（GS）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）蛋白、mRNA相對表達量；免疫熒光檢測Müller細胞內VEGF的表達。多組間比較采用單因素方差分析。結果細胞劃痕實驗檢測結果顯示，BMP4+ siSMAD9組細胞遷移率較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（F=68.319，P＜0.001）。流式細胞儀檢測結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞內ROS水平較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（F=52.158，P＜0.001）。Western blot、qPCR檢查結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞內GS、GFAP蛋白（F=42.715、36.618）、mRNA相對表達量（F=45.164、43.165）較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。免疫熒光檢測結果顯示，BMP4組、BMP4+NC組細胞內VEGF熒光強度較BMP4+siSMAD9組顯著升高，差異有統計學意義（F=46.384，P＜0.05）。結論BMP4靶向調控SMAD9表達，可上調VEGF表達，進而促進Müller細胞遷移及ROS生成。
目的觀察并分析缺氧狀態下SB431542對視網膜血管內皮細胞的作用。方法體內動物實驗：健康C57BL/6J小鼠48只，隨機分為正常組、氧誘導視網膜病變（OIR）組、OIR+二甲基亞砜（DMSO）組、OIR+SB431542組，每組各12只。小鼠17日齡時，作視網膜鋪片觀察新生血管情況；蘇木精-伊紅染色計數突破視網膜內界膜（ILM）的血管內皮細胞核數。體內細胞實驗：人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）分為正常組、缺氧組、缺氧+DMSO組、缺氧+SB431542組。噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞增殖情況；Matrigel體外三維成型法檢測SB431542對hRMEC管腔形成的影響；細胞劃痕實驗檢測hRMEC內細胞遷移情況；Seahorse XFe96細胞能量代謝分析儀測定細胞內糖酵解、糖酵解儲備、糖酵解容量的細胞外酸化率（ECAR）。多組間比較采用單因素方差分析。結果體內動物實驗：與正常組比較，OIR組新生血管增多（t=41.621，P＜0.001）；與OIR組比較，OIR+SB431542組突破ILM的血管內皮細胞核數明顯減少，差異有統計學意義（F=36.183，P＜0.001）。MTT比色法檢測結果顯示，與正常組、缺氧+SB431542組比較，缺氧組、缺氧+DMSO組細胞增殖顯著增多，差異有統計學意義（F=39.316，P＜0.01）；缺氧+SB431542組細胞增殖較缺氧+DMSO組顯著降低，差異有統計學意義（t=26.182，P＜0.001）。正常組、缺氧組、缺氧+DMSO組、缺氧+SB431542組細胞完整管腔形成數、遷移細胞數比較，差異均有統計學意義（F=34.513、41.862，P＜0.001、＜0.01）。與缺氧+DMSO組比較，缺氧+SB431542組細胞完整管腔形成數、遷移細胞數明顯下降，差異有統計學意義（t=44.723、31.178，P＜0.001、＜0.01）。細胞能量代謝測定結果顯示，與缺氧+DMSO組比較，缺氧+SB431542組細胞內糖酵解、糖酵解儲備的ECAR降低，糖酵解容量的ECAR增高，差異均有統計學意義（t=26.175、33.623、37.276，P＜0.05）。結論SB431542可抑制缺氧誘導的hRMEC增殖、遷移及管腔形成能力，并降低細胞糖酵解水平。
目的觀察高糖狀態下Nodal對猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A細胞）生物學行為的影響。方法將RF/6A細胞分為正常組、甘露醇組、高糖組、高糖聯合非特異小干擾RNA處理組（HG+NC組）、高糖聯合小干擾Nodal處理組（HG+siNodal組）。蛋白質免疫印跡法、實時熒光定量聚合酶鏈反應觀察細胞內Nodal蛋白、mRNA相對表達量；噻唑藍比色法檢測Nodal對RF/6A細胞增殖的影響；細胞劃痕實驗檢測Nodal對RF/6A細胞遷移能力的影響；Matrigel體外三維成型法檢測Nodal對RF/6A細胞管腔形成的影響；蛋白質免疫印跡法檢測RF/6A細胞內磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2（pERK1/2）蛋白相對表達量。多組間比較采用單因素方差分析。結果與HG+NC組比較，HG+siNodal組細胞內Nodal蛋白（F=33.469）、mRNA相對表達量（F=38.191）顯著下降，細胞增殖能力（F=28.548）、細胞遷移能力（F=24.182）顯著降低，細胞管腔形成數量顯著減少（F=52.643），差異均有統計學意義（P＜0.05）。與HG+NC組比較，HG+siNodal組細胞內pERK1/2蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（F=44.462，P＜0.01）。結論沉默Nodal表達可抑制高糖誘導的RF/6A細胞增殖、遷移及成管能力；其可能通過抑制pERK1/2的表達發揮作用。
目的觀察高糖狀態下NDRG1對恒河猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A細胞）增殖、遷移和管腔形成能力的影響。方法 將RF/6A細胞分為正常組、甘露醇組、高糖組、無靶基因的小干擾RNA（siRNA）陰性對照組（siRNA組）、30 nmol/L siRNA下調NDRG1基因組（siNDRG1組）、50 nmol/L siNDRG1組。正常組細胞常規培養；甘露醇組細胞加入25 mmol/L甘露醇培養；高糖組細胞加入25 mmol/L葡萄糖培養；siRNA組細胞加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA誘導培養；30、50 nmol/L siNDRG1組細胞均加入25 mmol/L葡萄糖，再分別用30、50 nmol/L siNDRG1進行誘導。所有細胞均孵育24 h進行后續實驗。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色觀察細胞增殖；細胞計數試劑盒8染色檢測細胞活性；實時定量聚合酶鏈反應、蛋白質免疫印跡法檢測細胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表達水平；細胞劃痕實驗觀察細胞遷移；細胞管腔形成實驗檢測管腔形成。兩組間比較采用雙尾Student t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。結果高糖組與正常組、甘露醇組細胞增殖率（t=36.659、57.645）、遷移率（t=24.745、33.638）、管腔形成數量（t=41.276、22.867）比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與正常組、甘露醇組比較，高糖組細胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（t=46.145、21.541、36.738、32.976，P＜0.001）。與siRNA組比較，30 nmol/L siNDRG1組、50 nmol/L siNDRG1組細胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相對表達量明顯降低，差異有統計學意義（t=44.275、40.7577、57.167、25.877，P＜0.01）。與正常組、siRNA組比較，30 nmol/L siNDRG1組細胞遷移率增加，差異有統計學意義（t=57.562、49.522，P＜0.01）。與正常組、siRNA組比較，30 nmol/L siNDRG1組相同視野下細胞管腔形成數量明顯增加，差異有統計學意義（t=63.446、42.742，P＜0.01）。結論下調NDRG1基因可誘導高糖狀態下RF/6A細胞活性、細胞遷移和管腔形成能力的提高。
目的篩選增生型糖尿病視網膜病變（DR）患者差異表達基因（DEG），為增生型DR（PDR）治療提供新的生物學治療靶點。方法基礎研究。2020年10月于天津醫科大學眼科醫院檢查確診的PDR患者3例（PDR組）及非糖尿病患者3例（對照組）納入研究。另外分別選取同期PDR、非糖尿病患者各40例并據此分為PDR驗證組、對照驗證組。PDR驗證組、對照驗證組行外周血驗證試驗；PDR組、對照組進行RNA 測序。采用轉錄組學（RNAseq）測序技術篩選PDR組、對照組DEG。對篩選得到的DEG進行基因注釋（GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）的信號通路富集分析和蛋白-蛋白互作網絡（PPI）分析。應用基因表達總集數據庫查找與PDR相關高通量數據行多隊列比對分析，通過Targetscan平臺對差異表達的miRNA進行靶基因預測，明確篩選所得DEG與PDR的相關性。采用逆轉錄聚合酶鏈反應、蛋白免疫印跡法對與PDR相關的DEG mRNA、蛋白表達進行驗證。PDR驗證組、對照驗證組之間PDR相關的DEG mRNA、蛋白相對表達量比較行配對t檢驗。結果RNAseq測序共篩選出1 337個DEG，上調基因419個，下調基因918個。具有低等電點的直接凋亡抑制蛋白結合蛋白（DIABLO）、鋅指和含BTB域10 （ZBTB10）、polo樣激酶3（PLK3）、調節亞單位1（PIK3R1）、B細胞易位基因3（BTG3）等基因在PDR組患者中差異表達。GO功能富集分析結果顯示，DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3等基因參與了與PDR相關的病理過程。KEGG富集分析結果顯示，細胞外基質受體作用、細胞因子調控通路、p53信號通路、半乳糖代謝等糖代謝途徑可能參與了DEG涉及過程。PPI分析結果提示，DEG關聯蛋白節點越大，關聯的節點數量越多，其中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3等基因對該作用網絡形成作用顯著。Targetscan平臺預測發現，DR患者房水、玻璃體、血漿中顯著差異miRNA與本研究所發現的DEG具有調控關系。與對照驗證組比較，PDR驗證組患者外周血中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1 mRNA、蛋白相對表達量上調，BTG3 mRNA、蛋白相對表達量下調。 結論PDR患者的DEG為DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3，其通過調控細胞增生、纖維化及氧化應激等生物學過程參與疾病進程。